Hoxa5、Hoxb5基因在高氧致CLD新生大鼠肺中表達(dá)及其與肺泡上皮細(xì)胞損傷修復(fù)障礙的關(guān)系.pdf

1、前言：
　　 早產(chǎn)兒慢性肺疾病(chroniclungdisease,CLD)是早產(chǎn)兒長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧或機(jī)械通氣治療或感染后最常見(jiàn)的和最嚴(yán)重的并發(fā)癥。早產(chǎn)兒CLD作為早產(chǎn)兒肺透明膜病治療的并發(fā)癥在1967年首次被Northway描述,也稱為支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)。氧療法是患有心肺疾病的早產(chǎn)兒最常應(yīng)用的一種治療手段。這一措施雖可改變患兒的低血氧狀態(tài)、挽救患兒的生命,但長(zhǎng)期

2、吸入高濃度的氧氣,可引起不同程度的肺損傷,嚴(yán)重者可發(fā)展為CLD。隨著機(jī)械通氣的廣泛開(kāi)展、早產(chǎn)兒管理技術(shù)的日益提高及肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用,使早產(chǎn)兒,特別是超低出生體重兒(extremely low birth weight,ELBW)(出生體重＜1000g存活率有了明顯改善,但隨之而來(lái)的是早產(chǎn)兒慢性肺疾病發(fā)生率的提高,國(guó)外已達(dá)30％-40％,國(guó)內(nèi)也有上升趨勢(shì)。由于尚缺乏有效的監(jiān)控和防治手段,其中10％-15％CLD患兒因嚴(yán)重肺功能障礙

3、而死于呼吸衰竭,存活者也需長(zhǎng)期依賴氧氣或機(jī)械通氣治療。
　　 初期肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell,AEC)損傷和晚期肺纖維化是CLD主要病理特征。以往的研究側(cè)重闡明CLD的AEC損傷(壞死或調(diào)亡)及其損傷后纖維組織替代AEC的病理過(guò)程及其可能機(jī)制,故目前多試圖通過(guò)減輕AEC損傷程度或減少肺組織膠原沉積而達(dá)到有效防止CLD的目的,但效果均不理想,至今在CLD防治措施方面的研究進(jìn)展緩慢。但恰是這種正常

4、肺上皮重塑障礙后的不可逆肺纖維化,嚴(yán)重影響了患兒的呼吸功能。那么損傷后的肺泡上皮為何不能完全修復(fù)而被纖維組織替代呢?目前尚無(wú)答案。因此,我們?cè)O(shè)想如以研究高氧致CLD中AEC的修復(fù)及其調(diào)控機(jī)制為切入點(diǎn),可能是解決肺上皮重塑障礙的重要突破口。
　　 AEC包括Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅠ alveolar epithelial cell,AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(typeⅡ alveolar epithelial cell,A

5、EC-Ⅱ),已證實(shí)AEC-Ⅰ為終末已分化細(xì)胞,無(wú)再生、增殖及分化能力;目前研究證實(shí)AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細(xì)胞或祖細(xì)胞,如體外培養(yǎng)的AEC-Ⅱ,可很快失去其特有的標(biāo)志SPC(surfactant proteinC),而表達(dá)AEC-Ⅰ的特有標(biāo)志AQP5(aquaporin5);用3H-TDR標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)的AEC-Ⅱ,2天后在AEC-Ⅱ臨近發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的AEC-Ⅰ等。由此可見(jiàn),若肺上皮損傷后,AEC-Ⅰ無(wú)再生、修復(fù)能力,完全依賴AEC-Ⅱ的增

6、殖、分化方能完成正常的肺上皮的重塑。
　　 近年來(lái),由于Hox基因(haomeobox genes,Hox genes)在進(jìn)化過(guò)程中的極大保守性和其在動(dòng)物胚胎發(fā)育分化中的作用,使之成為當(dāng)今世界生命科學(xué)最熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一。而有關(guān)Hox基因?qū)φ７谓M織發(fā)育及細(xì)胞分化調(diào)控作用的研究尚處起步階段。多數(shù)文獻(xiàn)闡明不同簇的Hox基因在胎肺發(fā)育的特定階段、特定部位表達(dá),對(duì)肺細(xì)胞系分化、成熟期重要作用,如HoxA5和HoxB5與支氣管分枝形成,

7、HoxB7、HoxB8和HoxB5與肺芽發(fā)育密切相關(guān)。有個(gè)別報(bào)道HoxB5異常表達(dá)與先天性肺隔離癥、HoxA5過(guò)渡表達(dá)與原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺氣腫發(fā)生有關(guān)。Hox基因?qū)ι蠓伟l(fā)育的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚,生后肺組織中仍存在Hox基因,其中表達(dá)最強(qiáng)的是HoxA5,其次是HoxB5,且這兩種基因主要定位于肺泡上皮細(xì)胞,而AEC-Ⅰ又為終末已分化細(xì)胞,故我們推測(cè),高氧CLD時(shí),能否因AEC-Ⅰ的HoxA5、HoxB5基因的表達(dá)降低而導(dǎo)致其向AEC

8、-Ⅰ的分化障礙。
　　 我們假設(shè):HoxA5和HoxB5基因可能是AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ分化的主控基因之一,其表達(dá)異常導(dǎo)致了損傷AEC-Ⅰ的修復(fù)障礙,最終發(fā)生肺上皮再生受抑,纖維組織增生替代的病理結(jié)局。如該假設(shè)成立,不僅可以闡明在正常早產(chǎn)鼠肺發(fā)育及CLD發(fā)生、發(fā)展中HoxA5、HoxB5時(shí)空表達(dá)模式,更重要的是發(fā)現(xiàn)Hox同源盒基因?qū)EC-Ⅱ分化的調(diào)控作用,從而為進(jìn)一步探索有效防治早產(chǎn)兒CLD的新途徑奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

9、　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　 一、動(dòng)物模型本實(shí)驗(yàn)是在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。足月新生Wistar大鼠(連同母鼠)被隨機(jī)分為2組;A組即試驗(yàn)組、單純高氧暴露;B組即對(duì)照組、正?？諝馕?將A組在生后24 h內(nèi)置于玻璃氧艙中,持續(xù)輸入氧氣,維持在FiO20.85,每日兩次監(jiān)測(cè)氧濃度(美國(guó)OM-25ME型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)),用鈣石灰吸收CO2,使其濃度小于0.5％(美國(guó)Dapex氣體分析儀),溫度20℃～25℃,濕度50％～7

10、0％,每天開(kāi)箱0.5h,稱重,添加水及飼料,更換摯料,與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒而致護(hù)理能力降低;空氣對(duì)照組置于空氣中(FiO20.21),飼養(yǎng)條件與高氧組相同。
　　 二、標(biāo)本采集和處理分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第1、3、7、14、21天分別從每組中隨機(jī)抽取8只新生鼠,腹腔注射5％水合氯醛6ml/kg麻醉后處死。立即打開(kāi)胸腔,無(wú)菌條件下分離肺組織,取右肺各葉置于無(wú)Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置

11、于0.1％DEPC的4％多聚甲醛(0.1MPBS,pH7.0～7.6)固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、動(dòng)態(tài)觀察各組新生大鼠的一般狀態(tài)、監(jiān)測(cè)體重。
　　 2、病理形態(tài)學(xué)研究(1)光鏡觀察:切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變。
　　 (2)肺泡面積/肺間隔面積(A/S)(美國(guó)Universal Ima-grog Porporation圖像分析系統(tǒng))。
　　

12、(3)放射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts,RAC)。
　　 (4)透射電鏡觀察AEC-Ⅱ超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 3、采用免疫組化(Immonohistochemistry,IH)、RT-PCR檢測(cè)肺組織AQP5、SPC的表達(dá)4、兩組肺組織HOXA5、HoxB5蛋白含量和基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化(1)免疫組化方法檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5在肺組織中表達(dá)的強(qiáng)度和部位。
　　 (2)RT-PC

13、R.技術(shù)檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5mRNA的表達(dá)。
　　 (3)原位雜交(Hybridization in situ,ISH)檢測(cè)表達(dá)HoxA5、HoxB5mRNA強(qiáng)度和部位。
　　 (4)Western-blot(WB)方法檢測(cè)肺組織HoxA5、HoxB5蛋白定量。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,單因素多水平比較采用One Way ANO

14、VA。兩樣本均數(shù)間比較采用Independent ttest。相關(guān)分析采用Spearman分析。結(jié)果以P＜0.05有意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新生大鼠一般狀態(tài)比較實(shí)驗(yàn)組新生鼠1d膚色紅潤(rùn),脫離氧氣無(wú)呼吸困難,3d離氧后出現(xiàn)呼吸急促,一般在7d后出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促明顯、皮膚蒼白以及離氧后不同程度的發(fā)紺,隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重,在14d后出現(xiàn)對(duì)氧的依賴。而對(duì)照組組則無(wú)以上異常表現(xiàn)。
　　 實(shí)

15、驗(yàn)組在高氧暴露7d開(kāi)始,新生大鼠體重與對(duì)照組相比下降(P＜0.05),隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng),體重差異逐漸明顯(P＜0.01)。
　　 二、兩組新生大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的比較
　　 1、肺組織的病理改變:
　　 2、A/S和RAC動(dòng)態(tài)變化:生后1d和3d,兩組MS和RAC均無(wú)差異(p＞0.05)。7d,14d,實(shí)驗(yàn)組的A/S、RAC明顯低于對(duì)照組(p＜0.01),A/S高于對(duì)照組(p＜0.01),21d時(shí)A/

16、S升至最高和RAC降至最低(p＜0.001)。
　　 3、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變
　　 三、高氧致慢性肺疾病新生鼠肺泡上皮細(xì)胞SPC和AQP5表達(dá)及動(dòng)態(tài)變化
　　 四、高氧致CLD新生大鼠肺組織HORA5和HOXB5基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 結(jié)論：
　　 1、新生大鼠持續(xù)高濃度氧氣暴露,可導(dǎo)致新生大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙和肺纖維組織增生等病理形態(tài)學(xué)改變,符合早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生發(fā)展特

17、點(diǎn)和解剖學(xué)改變。
　　 2、高氧肺損傷肺泡發(fā)育停滯或者肺泡損傷后修復(fù)障礙在新生鼠CLD早期即有明顯表現(xiàn),隨著新生鼠高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)這一特點(diǎn)更加明顯。
　　 3、新生大鼠肺組織SPC、AQP5主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞。AQP5在支氣管粘膜和小血管粘膜下層亦有表達(dá)。高氧7d后SPC表達(dá)量增多但是表達(dá)較紊亂,肺泡間隔細(xì)胞表達(dá)較多。
　　 4、根據(jù)肺泡上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的變化,高氧致肺損傷,肺泡上皮細(xì)胞改變可能為:AE

18、C-Ⅱ早期減少,隨后增加并維持在較高水平;AEC-Ⅰ進(jìn)行性減少。
　　 5、既然AEC-Ⅱ是AEC-Ⅰ的干細(xì)胞,推測(cè)高氧致新生鼠CLD肺泡損傷時(shí)可能存在AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ的分化障礙。
　　 6、HoxA5和HoxB5基因在正常新生鼠肺組織中表達(dá),在肺泡形成期,表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。兩個(gè)基因均在肺泡上皮中表達(dá),在肺泡嵴、肺泡拐角、肺泡連接處表達(dá)更明顯。
　　 7、高氧致新生鼠肺損傷導(dǎo)致HoxA5、HoxB5基因表達(dá)