高氧致BPD新生鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞SP-C表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、隨著呼吸機(jī)輔助通氣的開展及早產(chǎn)兒管理技術(shù)的日益提高和肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)的廣泛應(yīng)用，早產(chǎn)兒，尤其是極低出生體重兒的存活率有了明顯提高，隨之而來因長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧所導(dǎo)致的早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)卻成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的重要疾病。因其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前仍無有效的防治手段，這導(dǎo)致大概10～15％的患兒因嚴(yán)重的肺纖維化于生后1

2、年內(nèi)死于呼吸衰竭，存活者也因肺功能障礙需長(zhǎng)期的依賴吸入氧氣或口服激素甚至是機(jī)械通氣。
　　氧療是臨床上非常重要的治療手段，但高氧所導(dǎo)致的肺損傷其不能回避的嚴(yán)重副作用之一。高氧可以導(dǎo)致炎癥，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡，反應(yīng)性增生，活性蛋白表達(dá)的改變，肺泡間隔增寬，間質(zhì)纖維化從而導(dǎo)致早產(chǎn)兒出現(xiàn)支氣管肺發(fā)育不良。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞為高氧導(dǎo)致肺損傷的主要靶點(diǎn)，研究高氧引起的肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制可以更好的應(yīng)用輔助氧治療。
　　肺表面活性物質(zhì)

3、的缺乏和不成熟是發(fā)展成為支氣管肺發(fā)育不良的重要因素。由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的肺泡表面活性物質(zhì)蛋白(SP)可以降低肺泡表面張力，防止肺萎縮和保持功能殘氣量。SP共分四個(gè)亞型，SP-A，SP-B，SP-C，SP-D。SP-A，SP-D主要功能為參與宿主防御，SP-B，SP-C的主要功能為降低肺泡表面張力。有實(shí)驗(yàn)表明，成年鼠吸入高濃度的氧可以促使肺泡表面活性物質(zhì)分泌增加從而保護(hù)肺臟免于高氧的毒性損傷。疏水的SP-C被證實(shí)與板層小體的形成和分泌

4、有關(guān)，而板層小體在形成肺表面活性物質(zhì)單側(cè)及降低肺泡表面張力起到重要的作用最近的研究表明，大鼠剛出生時(shí)肺泡表面活性物質(zhì)蛋白的濃度較高，吸入正常濃度氧，肺泡表面活性蛋白的濃度逐漸下降，吸入高濃度氧的則SP-A，SP-B，SP-D的表達(dá)上升，但SP-C卻無表達(dá)上升，在高氧條件下SP-C的表達(dá)和分布的機(jī)制尚不明確。
　　本研究嘗試闡明高濃度氧導(dǎo)致SP-C在新生大鼠的肺組織中，大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，M LE-12細(xì)胞中堆積，自噬參與其發(fā)生

5、過程。高氧誘導(dǎo)通過激活非經(jīng)典自噬通路JNK信號(hào)分子上調(diào)自噬相關(guān)基因Atg7的表達(dá)，從而介導(dǎo)了SP-C在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的堆積。
　　實(shí)驗(yàn)材料和方法:
　　一、動(dòng)物模型制備
　　將新生的Wistar大鼠（連同母鼠）于生后12小時(shí)內(nèi)置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2=0.85，CO2濃度＜0.5，溫度25～27℃，濕度50～70％。每天定時(shí)開箱0.5小時(shí)，添加水、飼料及更換墊料，并與對(duì)照組交換母鼠以避免因氧氣中毒致喂

6、養(yǎng)能力下降。對(duì)照組FiO2=0.21（即空氣），具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同實(shí)驗(yàn)組。
　　二、細(xì)胞模型制備
　　小鼠肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞MLE-12細(xì)胞（美國(guó)，ATCC）。應(yīng)用HITES培養(yǎng)液（參考ATCC的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法），在37℃、5％CO2條件下將細(xì)胞按100，000細(xì)胞/孔接種在六孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，暴露至高氧環(huán)境(80％O2+5％CO2)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　三、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理
　　每組分別于實(shí)驗(yàn)后1、

7、3、5、7、14d隨機(jī)選取8只大鼠，處死后無菌取肺組織，用于肺形態(tài)學(xué)觀察免疫組織化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本置于4％多聚甲醛中固定;用于超微結(jié)構(gòu)觀察的標(biāo)本置于2.5％戊二醛中固定;Western Blot檢測(cè)的標(biāo)本置于Eppendorf管內(nèi)，于-80℃冰箱中凍存。
　　肺泡盥洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的采集;大鼠于魯米那麻醉后，正中切開頸部皮膚，暴露氣管，插人套管針并固定，繼之向肺內(nèi)緩慢注入生理鹽

8、水0.5ml，然后回抽，反復(fù)操作3次，收集BALF，按3000g/min的速度離心10分鐘，小心吸取上清液保存Eppendorf管內(nèi)-80℃凍存待測(cè)。
　　四、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)
　?。ㄒ唬w內(nèi)試驗(yàn)研究
　　1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SP-C在新生大鼠肺組織切片中的表達(dá)
　　2.Western blot方法檢測(cè)SP-C在新生大鼠肺組織中的表達(dá)
　　3.透射電鏡觀察AECⅡ超微結(jié)構(gòu)
　　4.ELISA方法

9、檢測(cè)BALF中SP-C的蛋白含量
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)研究
　　1.Western blot方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)
　　2.應(yīng)用免疫熒光的方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的分布
　　3.透射電鏡觀察MLE-12細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
　　4.ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　5.利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）預(yù)處理MLE-

10、12細(xì)胞后，檢測(cè)SP-C的表達(dá)情況
　　5.1 Western blot方法檢測(cè)SP-C在MLE-12中的表達(dá)
　　5.2.應(yīng)用免疫熒光的方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的分布
　　5.3透射電鏡觀察MLE-12細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
　　5.4 ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　6.檢測(cè)Atg7調(diào)節(jié)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的堆積
　　6.1 Western blot方法檢測(cè)A

11、tg7在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　6.2 SiRNA處理Atg7后Western blot方法檢測(cè)Atg7在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)
　　6.3 SiRNA處理Atg7后Western blot方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)
　　6.4 SiRNA處理Atg7后免疫熒光的方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)
　　6.5 SiRNA處理Atg7后ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C的

12、蛋白含量
　　7.檢測(cè)高氧是否通過激活JNK通路上調(diào)Atg7的表達(dá)
　　7.1分別應(yīng)用MAPK抑制劑U0126，SP600125，SB203580處理MLE-12細(xì)胞后Western blot方法檢測(cè)SP-C在細(xì)胞中的表達(dá)
　　7.2分別應(yīng)用MAPK抑制劑U0126，SP600125，SB203580處理MLE-12細(xì)胞后ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C的蛋白含量
　　7.3分別應(yīng)用JNK抑制劑SP60

13、0125或SiRNA JNK MLE-12細(xì)胞后Western blot方法檢測(cè)Atg7在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　7.4分別應(yīng)用JNK抑制劑SP600125和SiRNA JNK MLE-12細(xì)胞后免疫熒光方法檢測(cè)SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)
　　五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SSPS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬w內(nèi)試驗(yàn)研究
　　

14、1免疫組化學(xué)結(jié)果表明，隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，SP-C在新生大鼠肺組織內(nèi)表達(dá)逐漸增加;
　　2.Western blot結(jié)果表明，隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，SP-C在新生大鼠肺組織內(nèi)表達(dá)逐漸增加
　　3.隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)可見板層小體逐漸增多，并且觀察到在自噬小體內(nèi)出現(xiàn)板層小體樣結(jié)構(gòu);
　　4.ELISA結(jié)果表明BALF中SP-C的蛋白含量隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少;上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高氧刺激下，新生大鼠

15、肺組織中肺泡Ⅱ細(xì)胞內(nèi)SP-C表達(dá)水平逐漸增多，并且堆積在細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)自噬體吞噬。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)研究
　　1.Western blot結(jié)果表明，隨高氧刺激時(shí)間延長(zhǎng)，SP-C在MLE-12細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平逐漸增加;
　　2.免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨高氧刺激時(shí)間延長(zhǎng)，SP-C在MLE-12細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的強(qiáng)度逐漸增加;
　　3.透射電鏡的結(jié)果表明，在高氧刺激的作用下，在MLE-12細(xì)胞內(nèi)可見板層小體數(shù)目逐漸增多

16、，且呈現(xiàn)空泡狀改變，并且被自噬小體所吞噬;
　　4.ELISA結(jié)果表明，在高氧作用下的MLE-12細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C蛋白含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少;
　　5.利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)預(yù)處理MMLE-12細(xì)胞，抑制細(xì)胞自噬功能，進(jìn)一步分析SP-C的表達(dá)變化情況:
　　5.1 Western blot結(jié)果表明，加入自噬抑制劑3-MA后SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá)逐漸降低;
　　5.2免疫熒光

17、實(shí)驗(yàn)表明，自噬抑制劑3-MA可以明顯抑制SP-C在MLE-12細(xì)胞中的表達(dá);
　　5.3自噬抑制劑3-MA處理后，透射電鏡觀察到MLE-12細(xì)胞內(nèi)板層小體數(shù)量減少
　　5.4 ELISA結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA可以明顯增加MLE-12細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C蛋白的含量;
　　6.分析SP-C在MLE-12細(xì)胞中堆積的分子機(jī)制
　　6.1 Western blot結(jié)果表明，隨高氧時(shí)間延長(zhǎng)，自噬相關(guān)基因Atg7在

18、MLE-12細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的逐漸增加;
　　6.2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)MLE-12細(xì)胞中Atg7的表達(dá);
　　6.3可以明顯抑制高氧刺激所致的MLE-12細(xì)胞內(nèi)的SP-C表達(dá)水平的增加;
　　6.4免疫熒光結(jié)果表明，下調(diào)MLE-12細(xì)胞中Atg7的表達(dá)明顯減弱高氧刺激所致的MLE-12細(xì)胞內(nèi)SP-C的堆積;
　　6.5 ELISA結(jié)果表明，下調(diào)MLE-12細(xì)胞中Atg7的表達(dá)可以明顯抑制高氧刺激所致的ML

19、E-12細(xì)胞培養(yǎng)液上清中SP-C含量的減少;
　　7.進(jìn)一步分析高氧誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞中Atg7表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制:
　　7.1用不同MAPK信號(hào)分子抑制劑U0126，SP600125，SB203580預(yù)處理MLE-12細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)特異性JNK信號(hào)分子抑制劑SP600125可以明顯抑制高氧所致的MLE-12細(xì)胞內(nèi)SP-C表達(dá)水平增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SP-C的減少以及MLE-12細(xì)胞內(nèi)SP-C免疫熒光信號(hào)的增加，同時(shí)可以明

20、顯抑制細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因Atg7表達(dá)水平的增加;
　　7.3應(yīng)用JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細(xì)胞后或利用JNK SiRNA抑制細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)分子的活化后，可以明顯抑制細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因Atg7表達(dá)水平的增加及SP-C表達(dá)水平的增加。
　　結(jié)論:
　　1、高氧條件下，SP-C在新生鼠的肺組織肺泡Ⅱ細(xì)胞及體外培養(yǎng)的MLE-12細(xì)胞中表達(dá)水平增加，但肺泡盥洗液中和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含量的減少說明SP-C在肺泡Ⅱ細(xì)胞中堆