血管活性腸肽對高氧損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞再生修復(fù)的調(diào)控及其STAT3信號機(jī)制.pdf

1、第一部分、高氧暴露對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞存活的影響
　　 目的：研究高氧誘導(dǎo)的AECⅡ損傷、死亡情況及高氧暴露后細(xì)胞增殖的變化，從而了解高氧對AECⅡ存活的影響。
　　 方法：將MLE-12細(xì)胞暴露于>90％體積分?jǐn)?shù)的氧制備高氧損傷模型，在高氧暴露不同時點(diǎn)利用Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死，酶標(biāo)儀檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性，DAPI染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)形態(tài)

2、，透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變、流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化以了解高氧對線粒體結(jié)構(gòu)及功能的損害，MTT法及細(xì)胞周期檢測反映高氧狀態(tài)下的MLE-12細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示高氧暴露0.5h，1 h，2 h，4 h細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死率與空氣對照組相比無顯著差異，高氧暴露后6 h細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死率明顯增加(p<0.01)，高氧暴露后12 h、24 h更

3、多細(xì)胞發(fā)生早期凋亡、晚期凋亡及壞死(p<0.01)，且發(fā)生死亡的細(xì)胞大部分集中于代表晚期凋亡及壞死的右上象限。酶標(biāo)儀檢測caspase-3活性結(jié)果顯示與空氣對照組比較，高氧暴露后0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h，12 h，24 h各組OD405nm無顯著差異。DAPI染色熒光顯微鏡觀察，與空氣對照組比較，高氧暴露0.5 h，1 h，2 h，4 h細(xì)胞核及染色質(zhì)形態(tài)未見明顯變化，胞核呈圓形，邊緣清晰，染色均勻，高氧暴露6 h，1

4、2 h，24 h細(xì)胞核腫脹，體積變大，未見核固縮及染色質(zhì)聚集現(xiàn)象。JC-1染色流式細(xì)胞儀分析及熒光顯微鏡觀察，與空氣對照組相比，高氧暴露0.5 h，1 h，2 h，4h線粒體膜電位無明顯變化，高氧暴露后6 h，12 h，24 h，隨暴露時間延長，線粒體膜電位下降趨勢愈發(fā)明顯(p<0.01)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高氧暴露后線粒體發(fā)生腫脹，內(nèi)膜及外膜均遭到破壞。MTT結(jié)果顯示，與同時點(diǎn)空氣對照組相比，高氧暴露0.5 h，1 h，2 h，4 h

5、細(xì)胞OD490nm值無顯著變化，高氧暴露6 h，12 h，24 h隨暴露時間延長OD490nm值降低趨勢越為明顯(p<0.01)。細(xì)胞周期分析顯示高氧暴露0.5h，1 h，2 h，4 h G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞比例與空氣對照組相比無顯著差異，大部分細(xì)胞分布于S及G2/M期即DNA合成及分裂期，高氧暴露6 h，12 h，24 h G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(p<0.01)，而S期、G2/M比例顯著降低(p<0.01)，大部分細(xì)

6、胞分布于G0/G1期即靜止期及DNA合成前期。
　　 結(jié)論：高氧可以時間依賴性的方式誘導(dǎo)AECⅡ損傷及死亡，抑制AECⅡ增殖，從而使得AECⅡ存活減少。>90％氧體積分?jǐn)?shù)的高氧暴露后，AECⅡ表現(xiàn)為細(xì)胞膜的破壞、細(xì)胞核及線粒體的腫脹等脹亡的特征，而磷脂酰絲氨酸外翻、核固縮、染色質(zhì)聚集、凋亡相關(guān)蛋白酶活化等凋亡特征不明顯。
　　 第二部分、血管活性腸肽對高氧損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞再生修復(fù)的影響
　　 目的：研究VIP

7、干預(yù)后高氧暴露的AECⅡ損傷、死亡情況及細(xì)胞增殖的變化，從而了解VIP對高氧損傷后AECⅡ再生修復(fù)的影響。
　　 方法：MLE-12細(xì)胞進(jìn)行高氧暴露及VIP干預(yù)，MTT法及細(xì)胞周期檢測細(xì)胞增殖，了解VIP對高氧暴露細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位的變化，Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡及壞死，DAPI染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)形態(tài)，了解VIP對高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。

8、>　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，與空氣對照組相比，高氧組氧暴露后24 h，MLE-12細(xì)胞OD490nm值顯著降低(p<0.05)，高氧VIP各濃度組與高氧組比較，隨加入的VIP終濃度由10-9至10-6 M升高，OD490nm值亦漸升高，高氧VIP10-7M組與高氧VIP10-10M組、高氧VIP10-9M組、高氧VIP10-8M組比較，OD490nm值差異有顯著性(p<0.01)。Annexin-V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示

9、，高氧VIP10-7M組細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率與單純高氧暴露組相比明顯降低(p<0.01)，但仍高于空氣對照組，VIP干預(yù)后死亡的細(xì)胞仍大部分分布于代表晚期凋亡及壞死的右上象限。JC-1染色流式細(xì)胞儀分析顯示，與單純高氧組相比，高氧VIP10-7M組線粒體膜電位下降幅度減少(p<0.01)。DAPI染色熒光顯微鏡下觀察，VIP干預(yù)后高氧暴露的MLE-12細(xì)胞仍可見增大的胞核，而無核固縮及染色質(zhì)聚集。流式細(xì)胞學(xué)細(xì)胞周期檢測結(jié)果發(fā)

10、現(xiàn)，高氧VIP10-7M組與單純高氧組比較，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(p<0.01)，S期、G2/M期比例顯著增高(p<0.01)，但兩者均未達(dá)空氣對照組水平。
　　 結(jié)論：VIP可以劑量依賴性的方式促進(jìn)高氧暴露的AECⅡ的增殖，減輕高氧暴露對細(xì)胞增殖的抑制作用，同時VIP通過穩(wěn)定線粒體功能，減少細(xì)胞高氧性損傷及死亡，從而改善高氧暴露后AECⅡ的存活。VIP干預(yù)后高氧暴露細(xì)胞仍表現(xiàn)出胞膜破壞、胞核腫脹等脹亡的特征，提示VIP

11、可減少高氧誘導(dǎo)的AECⅡ的脹亡，脹亡可能與凋亡一樣也是可調(diào)控的過程。
　　 第三部分、血管活性腸肽促進(jìn)高氧損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞再生修復(fù)的STAT3信號機(jī)制
　　 目的：研究高氧暴露及VIP干預(yù)后JAK2/STAT3的活化以及STAT3表達(dá)敲低后VIP對高氧暴露AECⅡ增殖、死亡的影響，探討VIP調(diào)控高氧損傷AECⅡ再生修復(fù)的可能信號機(jī)制。
　　 方法：Western Blot及凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophor

12、etic Mobility ShiftAssay，EMSA)檢測VIP干預(yù)前后高氧暴露的MLE-12細(xì)胞JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)，STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)的表達(dá)以及STAT3與DNA結(jié)合活性，了解高氧損傷過程中JAK2/STAT3活化情況和VIP對JAK2/STAT3活化影響，RNAi技術(shù)敲低MLE-12細(xì)胞STAT3表達(dá)后采用Annexin V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞死亡、MTT法檢測細(xì)胞增

13、殖情況，了解STAT3是否介導(dǎo)了VIP對高氧損傷AECⅡ再生修復(fù)的調(diào)控。
　　 結(jié)果：Western Blot結(jié)果顯示，在高氧暴露后2 h，p-JAK2蛋白表達(dá)增加，4 h達(dá)峰值，高氧暴露后6 h表達(dá)有所下降，高氧暴露后12 hp-JAK2蛋白表達(dá)回復(fù)至未干預(yù)時水平，與此同時，高氧暴露24 h內(nèi)的各時點(diǎn)JAK2總蛋白水平并無顯著變化，高氧暴露VIP10-7M組細(xì)胞與單純高氧暴露組細(xì)胞相比，24 h內(nèi)的各檢測時間點(diǎn)JAK2總蛋白水

14、平、JAK2發(fā)生磷酸化的時點(diǎn)及p-JAK2表達(dá)無顯著變化。p-STAT3蛋白表達(dá)水平在高氧暴露后2 h增加，4 h最強(qiáng)，6 h后有所下降，高氧暴露后12 h p-STAT3蛋白表達(dá)與未干預(yù)時水平無差異，在p-STAT3表達(dá)增強(qiáng)的同時，STAT3總蛋白表達(dá)在高氧暴露24 h內(nèi)各時點(diǎn)無明顯差異，10-7M VIP干預(yù)后，高氧暴露細(xì)胞STAT3總蛋白水平和STAT3磷酸化的時效性均無變化，但p-STAT3表達(dá)較單純高氧暴露組明顯增加(p<0.

15、05)。EMSA結(jié)果顯示，高氧暴露后2 h即可見STAT3 DNA結(jié)合活性增加，4 h達(dá)峰值，6 h減弱，12 h降至對照組水平，10-7M VIP干預(yù)后，高氧暴露細(xì)胞中STAT3與DNA結(jié)合活性進(jìn)一步增強(qiáng)(p<0.01)。Annexin-V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與單純高氧暴露的未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，高氧STAT3 siRNA組早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡及壞死細(xì)胞顯著增多(p<0.01)，而高氧VIP未轉(zhuǎn)染組早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡

16、和壞死細(xì)胞顯著降低(p<0.01)，與高氧VIP未轉(zhuǎn)染組相比，高氧VIP STAT3 siRNA組早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡及壞死細(xì)胞數(shù)明顯增加(p<0.05)。MTT結(jié)果顯示，與高氧未轉(zhuǎn)染組相比，高氧STAT3 siRNA組OD490nm值明顯降低(p<0.01)，高氧VIP未轉(zhuǎn)染組OD490nm值顯著增高(p<0.01)，高氧VIP STAT3 siRNA組較之高氧VIP未轉(zhuǎn)染組，OD490nm值明顯降低(p<0.01)。