高氧致BPD新生鼠Z0-1調(diào)節(jié)肺上皮屏障結(jié)構(gòu)及功能研究.pdf

1、前言：
　　 氧療是臨床上搶救新生兒呼吸衰竭最有效的方法之一,應(yīng)用高體積分?jǐn)?shù)氧進(jìn)行機(jī)械通氣治療雖然挽救了大量新生兒的生命,但也不可避免地導(dǎo)致了高氧肺損傷的發(fā)生,嚴(yán)重者甚至發(fā)展成以肺部炎癥和纖維化為主要特征的另一慢性肺部疾病一支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)。長時間吸入高濃度氧氣目前被學(xué)者們認(rèn)為是BPD發(fā)生的最主要原因及最危險因素。臨床上高氧誘導(dǎo)的肺損傷仍是造成早產(chǎn)兒尤其是極低出生體重

2、兒死亡或致殘的主要原因之一,現(xiàn)已成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾病,但其具體的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。因此,探索高氧致BPD的發(fā)生機(jī)制是國內(nèi)外研究的焦點問題。
　　 BPD的主要病理變化早已被證實,即是早期肺水腫,肺組織炎癥反應(yīng)以及晚期肺組織的纖維化。目前有關(guān)其發(fā)病機(jī)理的研究多集中在BPD晚期肺纖維化的研究,但間質(zhì)纖維化一旦形成,將導(dǎo)致不可逆的呼吸循環(huán)障礙,威脅患兒生命。因此,探尋BPD的早期發(fā)病機(jī)制,探索疾病發(fā)展的可逆轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)

3、,對于該病的早期診斷,早期防治尤為重要。以往的研究多著重于對肺組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的研究,而對肺水腫機(jī)制的研究甚少,且目前抗炎、抗氧化的早期治療對BPD卻沒有取得確切的療效。因此,本研究嘗試以探索高氧肺損傷急性期—肺水腫形成機(jī)制為切入點,試圖為早產(chǎn)兒高氧肺損傷的早期防治奠定實驗基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。以往研究表明肺泡上皮屏障功能異常與成人急性肺損傷密切相關(guān),肺泡上皮細(xì)胞間緊密連接(tightjunction,TJ)是維系和調(diào)控其屏障通

4、透性的主要結(jié)構(gòu),設(shè)想肺泡上皮細(xì)胞屏障功能異常在新生鼠高氧肺損傷急性期肺水腫的發(fā)生中也同樣發(fā)揮了重要作用,那么肺水腫時,緊密連接結(jié)構(gòu)是否有改變,這種改變是否影響了屏障功能,緊密連接中主要何種成分出現(xiàn)了變化、通過何種途徑來完成呢?目前尚不清楚。
　　 ZO-1(zonulaoccludensproteins-1)是緊密連接胞漿附著蛋白,在緊密連接起中介和橋梁作用,其破壞后緊密連接的功能隨之變化。到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)缺乏ZO-1的緊密

5、連接;有報道稱緊密連接鏈的形成必須有ZO-1中SH3/GUK結(jié)構(gòu)域的參與;敲除TIP-1基因后,缺乏ZO-1的細(xì)胞間緊密連接形成延遲:ZO-1表達(dá)水平下降或缺失,會造成TJ結(jié)構(gòu)松散甚至分解,最終影響緊密連接屏障功能的完整性?；赯O-1的上述生理特性,在肺組織的特定表達(dá)方式及其在緊密連接的重要作用提示我們探索ZO-1在高氧肺損傷急性期肺水腫肺泡上皮細(xì)胞通透屏障中的作用。
　　 本研究以高氧致新生鼠肺水腫模型和原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞

6、所建立的肺上皮屏障模型為對象,采用透射電鏡、Westernblotting、RT-PCR及免疫熒光等技術(shù)從組織、細(xì)胞、蛋白及核酸水平證實高氧肺損傷肺上皮ZO-1的表達(dá)變化及其作用,并應(yīng)用跨膜電阻測量記錄模式和單細(xì)胞層示蹤劑流量測定來證明暴露于高氧中的肺上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能變化,闡明肺上皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)異常導(dǎo)致肺內(nèi)通透屏障受損是高氧致肺水腫的重要機(jī)制。
　　 實驗材料及方法：
　　 一、動物模型制備
　　 本實驗在

7、中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實驗動物中心完成。新生Wistar大鼠生后12h之內(nèi)隨機(jī)分為高氧組(實驗組)和空氣組(對照組)。組置于玻璃氧箱中,持續(xù)輸入氧氣,FIO2=0.85±0.02(美國OM-25ME型測氧儀監(jiān)測)。用鈉石灰吸收CO2,使其濃度＜0.5%(Dapex氣體分析儀),溫度22-25℃,濕度60%-70%。每天定時開箱15min,添水、飼料及更換摯料,并與空氣組交換母鼠以免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。對照組FIO2:0.21,具體方

8、法及實驗控制因素同實驗組。
　　 二、標(biāo)本采集和處理
　　 每組分別于實驗后1,3,5和7d隨機(jī)選取15只稱重,5%哥拉腹腔注射(0.6ml/100g)麻醉后,分離氣管,打開胸腔,暴露心肺,經(jīng)氣管緩慢注入4%多聚甲醛,然后置于4%多聚甲醛中,4℃過夜,石蠟包埋,制作4μm組織切片,用于肺形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光化學(xué)檢測。或于打開胸腔后,剪開左心耳,經(jīng)右心室插入套管至肺動脈,注入10ml生理鹽水洗凈肺內(nèi)殘血,收集肺組織,置于無

9、Rnase的Eppendorf管中,液氮速凍,-80℃冰箱保存,用于RT-PCR及Western-blot檢測。
　　 三、AECⅡ細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 新生Wistar大鼠經(jīng)5%水合氯醛(0.6ml/100g)腹腔麻醉后處死,無菌條件下迅速取肺,分別采用胰酶和膠原酶消化、離心分離純化新生鼠AECⅡ細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng),經(jīng)SP-C蛋白免疫熒光染色及透射電鏡方法鑒定后用于實驗。
　　 四、體外肺上皮屏障建立

10、
　　 將存活率大于90%AECⅡ以106/cm2密度接種于可通透的纖維連接蛋白包被的多聚碳濾膜上(孔徑0.4μm2,TRANSWELL,ComingInc),上室和下室液均為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,連續(xù)培養(yǎng)5天后形成緊密連接的單層細(xì)胞片,經(jīng)形態(tài)、表型和功能鑒定后用于實驗。
　　 五、實驗方法和觀察指標(biāo)
　　 (一)肺形態(tài)學(xué)觀察:切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下動態(tài)觀察肺組織的病理改變及進(jìn)行肺損傷評分。

11、r>　　 (二)肺組織濕干比(W/D)和肺血管外肺水含量(ELWC)測定。
　　 (三)FD4檢測肺上皮通透性。
　　 (四)免疫熒光及Western-blot技術(shù)觀察和檢測肺組織、原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞及肺上皮屏障ZO-1蛋白的表達(dá)狀態(tài)及水平。
　　 (五)RT-PCR檢測肺組織、原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞及肺上皮屏障ZO-1mRNA表達(dá)水平。
　　 (六)透射電鏡觀察肺組織上皮細(xì)胞間及體外肺上皮屏障緊密連接

12、結(jié)構(gòu)。
　　 (七)跨膜電阻測量記錄模式和單細(xì)胞層示蹤劑流量測定肺上皮屏障功能。
　　 六、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,計量資料采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni,顯著性檢驗水平為0.05。
　　 結(jié)果：
　　 一、肺形態(tài)學(xué)觀察
　　 (一)肺組織病理改變
　　 對照組3d時終末

13、氣腔大小欠規(guī)則,數(shù)量較多,肺泡間隔稍厚;實驗組3d時可見小血管擴(kuò)張、充血,肺泡問隔內(nèi)有少量出血、水腫,滲出以中性粒細(xì)胞為主,間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多。對照組5d時肺泡形念較規(guī)則,大小均勻;實驗組5d時肺泡間隔進(jìn)一步增厚,水腫繼續(xù)加重,肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤。對照組7d時肺泡化,肺泡分隔逐步增加,小肺泡數(shù)量增多等;而實驗組出現(xiàn)肺泡內(nèi)出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)細(xì)胞增多,同時可見透明膜形成、小肺泡數(shù)量減少及肺泡分隔減少等。
　　 (

14、二)肺損傷評分
　　 高氧1d較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),實驗組3d,5d和7d肺損傷評分明顯高于對照組(P＜0.01)。
　　 二、肺組織濕干比(W/D)和肺血管外肺血(EVLW)
　　 W/D于實驗后1d,兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),3d起W/D實驗組升高(P＜0.05),5d、7d更明顯(P＜0.01);ELWC于實驗后1d,兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),3d、5d和7d實驗組明

15、顯升高(P＜0.01)。
　　 三、肺上皮通透性
　　 兩組1d無統(tǒng)計學(xué)差異,3d高于對照組(P＜0.05),5d和7d明顯高于對照組(P＜0.01)。
　　 四、肺組織、原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞及肺上皮屏障ZO-1及occludin蛋白的表達(dá)狀態(tài)及水平
　　 (一)肺組織ZO-1及occludin蛋白表達(dá)
　　 實驗組和對照組比較,生后1d,兩組ZO-1蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05),生后3d、5d

16、和7d實驗組較對照組明顯減少(P＜0.01);免疫熒光示對照組ZO-1紅色熒光成連續(xù)性分布于肺上皮細(xì)胞膜,實驗組紅色熒光成斷續(xù)分布且熒光強(qiáng)度減弱,高氧5d和7d改變最明顯。
　　 實驗組和對照組比較,生后1d和3d,兩組occludin蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05),生后5d蛋白表達(dá)開始減少(P＜0.05),7d實驗組較對照組明顯減少(P＜0.01);免疫熒光示對照組occludin綠色熒光成連續(xù)性分布于肺上皮細(xì)胞膜,實驗組綠色

17、熒光成斷續(xù)分布且熒光強(qiáng)度減弱,高氧7d改變最明顯。
　　 (二)原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞ZO-1及occludin蛋白表達(dá)
　　 實驗組和對照組比較,培養(yǎng)24h,兩組ZO-1蛋白表達(dá)無差異(P＞0.05),培養(yǎng)48h和72h實驗組較對照組明顯減少(P＜0.01);免疫熒光示對照組ZO-1紅色熒光成網(wǎng)格狀連續(xù)分布于AECⅡ細(xì)胞膜,實驗組紅色熒光成斷續(xù)分布且熒光強(qiáng)度減弱,高氧72h改變最明顯。
　　 實驗組和對照組比較,

18、培養(yǎng)24h、48h和72h實驗組較對照組均有減少,但兩組occludin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05):免疫熒光示對照組與實驗組occludin綠色熒光均成連續(xù)性分布于AECⅡ細(xì)胞膜。
　　 (三)肺上皮屏障ZO-1及occludin蛋白表達(dá)
　　 實驗組24h、48h和72hZO-1蛋白表達(dá)較對照組明顯減少(P＜0.01);免疫熒光示對照組ZO-1紅色熒光成網(wǎng)格狀連續(xù)分布于肺上皮,實驗組紅色熒光成斷續(xù)分布且熒

19、光強(qiáng)度減弱,高氧72h改變最明顯。
　　 實驗組24h、48h和72hoccludin蛋白表達(dá)實驗組較對照組均有減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);免疫熒光示對照組與實驗組occludin綠色熒光均成連續(xù)性分布于AECⅡ細(xì)胞膜。
　　 五、肺組織、原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞及肺上皮屏障ZO-1及occludinmRNA表達(dá)水平
　　 (一)肺組織ZO-1及occludinmRNA表達(dá)水平
　　 生后1d、

20、3d、5d和7d實驗組ZO-1mRNA表達(dá)水平較對照組明顯減少(P＜0.01)。實驗組和對照組比較,生后1d和3d實驗組occludinmRNA表達(dá)水平較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),生后5d實驗組occludinmRNA表達(dá)水平較對照組減少(P＜0.05),生后7天減少最明顯(P＜0.01)。
　　 (二)原代培養(yǎng)AECⅡ細(xì)胞ZO-1及occludinmRNA表達(dá)水平
　　 實驗組和對照組比較,培養(yǎng)24h,兩

21、組ZO-1mRNA表達(dá)水平無差異(P＞0.05),培養(yǎng)48h,實驗組較對照組開始減少(P＜0.05),培養(yǎng)72h實驗組較對照組明顯減少(P＜0.01)。實驗組和對照組比較,培養(yǎng)24h、48h和72h實驗組較對照組occludinmRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (三)肺上皮屏障ZO-1及occludinmRNA表達(dá)水平
　　 實驗組24hZO-1mRNA表達(dá)水平較對照組增高(P＜0.05),實驗組

22、48hZO-1mRNA表達(dá)水平較對照組減少(P＜0.05),實驗組72hZO-1mRNA表達(dá)水平較對照組明顯減少(P＜0.01)。實驗組24hoccludinmRNA表達(dá)水平較對照組增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),實驗組48h和72hoccludinmRNA表達(dá)水平實驗組較對照組均有減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 六、肺組織上皮細(xì)胞間及體外肺上皮屏障緊密連接形態(tài)
　　 (一)肺組織上皮細(xì)胞間緊

23、密連接
　　 對照組肺上皮細(xì)胞間緊密連接位于上皮頂端,成致密線性結(jié)構(gòu);實驗組5d可見緊密連接成線性開放狀態(tài),7d開放縫隙最明顯,1d和3d未見開放。
　　 (二)體外肺上皮屏障緊密連接
　　 對照組肺上皮細(xì)胞間緊密連接位于上皮頂端,成致密線性結(jié)構(gòu);實驗組48h可見緊密連接成線性開放狀態(tài),72h開放縫隙最明顯,24h未見開放。
　　 七、體外肺上皮屏障功能
　　 (一)跨上皮電阻
　　 實驗

24、組24h較對照組減少有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),48h和72h減少更加明顯(P＜0.01)。
　　 (二)單細(xì)胞層示蹤劑流量
　　 實驗組24h較對照組增加無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),實驗組48h較對照組增加有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),72h增加更加明顯(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (一)本研究在進(jìn)一步證實高氧致BPD早期存在肺水腫基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了此階段肺上皮屏障緊密連接開放,此變化與緊密連