彈性蛋白系統(tǒng)在高氧致新生鼠支氣管肺發(fā)育不良中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、目的:觀察彈性蛋白系統(tǒng)在支氣管肺發(fā)育不良（ bronchopulmonary dysplasia，BPD）小鼠肺組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，并通過對(duì)關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase inhibitor，NE）進(jìn)行干預(yù)，以初步揭示彈性蛋白系統(tǒng)在BPD發(fā)生及發(fā)展過程中的作用以及可能機(jī)制，為尋求有效的BPD防治藥物和治療策略，提高治療效果提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.彈性蛋白系統(tǒng)在高

2、氧致新生鼠BPD的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律
　　利用新生小鼠肺發(fā)育的生物學(xué)規(guī)律與人類肺發(fā)育規(guī)律相似這一特點(diǎn)，通過將新生12 h C57BL/6小鼠持續(xù)吸入高氧（85％）構(gòu)建BPD動(dòng)物模型，應(yīng)用組織病理學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)法（dual immunofluorescence， DIF）和分子生物學(xué)技術(shù)等，檢測(cè)出生后1~21 d正常小鼠和BPD小鼠中彈性蛋白系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，確定高氧對(duì)肺彈性蛋白數(shù)量和分布的影響，判斷與肺彈性蛋白組裝、分解相關(guān)蛋白的變

3、化及功能差異，分析與BPD發(fā)生的關(guān)系。
　　2.彈性蛋白酶抑制劑Elafin對(duì)高氧致新生鼠BPD的保護(hù)作用
　　建立高氧致新生小鼠BPD模型，通過氣道滴注中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑（neutrophil elastase inhibitor，NEI）Elafin干預(yù)彈性蛋白系統(tǒng)。將孕19~21 d自然分娩的C57母鼠和新生小鼠，在生后12 h內(nèi)（記為日齡0 d），隨機(jī)分為3組：（1）空氣對(duì)照組（FiO2＝0.21，Air）；

4、（2）模型對(duì)照組（FiO2＝0.85，O2）。在小鼠日齡3 d、6 d、10 d時(shí)，氣道滴注10μl/g（小鼠體重）乳酸林格溶液（lactated-ringer solution，L/R）；（3）模型給藥組（FiO2＝0.85，O2），在小鼠日齡3 d、6 d、10 d時(shí)，將按照10μl/g（小鼠體重），Elafin40 ng/g通過氣道滴注入小鼠肺組織內(nèi)。應(yīng)用組織病理學(xué)觀察肺組織形態(tài)變化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked

5、immunoabsorbent Assay，ELISA）檢測(cè)肺組織NE活性和尿液鎖鏈素含量；透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）檢測(cè)彈性纖維超微結(jié)構(gòu)。
　　3. Elafin對(duì)高氧致新生鼠BPD肺TGF-β/Smad2通路的影響
　　建立高氧致新生小鼠BPD模型，給予NEI Elafin（40 ng/g），ELISA檢測(cè)肺組織中活化型和總轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（ transformi

6、ng growth factor-β，TGF-β1）的含量；免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry， IHC）檢測(cè)磷酸化Smad2（phospho-Smad2，pSmad2）在肺組織細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量與分布；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（ quantitative real-time polymerase chain reaction，Q-RT-PCR）檢測(cè)小鼠肺組織中的彈性蛋白原（tropoelastin）、TGF-β1、TT

7、F-1和HGF-3β基因的表達(dá)水平；蛋白印跡法（western Blot，WB）測(cè)定pSmad2表達(dá)，以及pSmad2占總Smad2的比例。
　　結(jié)果:
　　1.新生12 h以內(nèi)的C57小鼠持續(xù)85%O2暴露21 d，可見彈性蛋白過度無序表達(dá)于受損肺泡，次級(jí)脊與肺泡數(shù)量顯著減少，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化，肺泡再分化過程受阻。結(jié)果提示，高氧致新生小鼠BPD模型建立成功。
　　高氧暴露促進(jìn)合成、分泌彈性蛋白原的肌成纖維細(xì)

8、胞（myofibroblast）顯著分化增殖，彈性蛋白原合成、分泌顯著增加。促進(jìn)彈性蛋白原脫氨基轉(zhuǎn)化成熟的賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，Lox）與賴氨酰氧化酶樣1（lysyl oxidase-like1，Loxl-1） mRNA表達(dá)上調(diào)；ECM蛋白結(jié)合受體整合素αv與彈性蛋白共表達(dá)增強(qiáng)；以彈性蛋白為最適底物的NE表達(dá)增加（P<0.05）。
　　2. Elafin給予，小鼠肺泡數(shù)量增加，肺泡腔明顯變小；高氧模型組（7.1

9、7±2.25）的RAC比Air組（13.75±1.81）顯著降低（P<0.01），而Elafin處理組比模型顯著增高（10.05±3.12）（P<0.01）；與高氧組相比，Elafin處理組彈性蛋白異常增生量顯著減少（P<0.01），次級(jí)脊數(shù)量明顯增加，彈性蛋白在肺泡間隔中沉積減少，而主要在次級(jí)脊頂端分布；透射電鏡檢測(cè)顯示，與高氧組相比， Elafin處理組小鼠彈性蛋白排列更加規(guī)整，與之交聯(lián)形成彈性纖維的微纖維也排列成正常的條索狀。

10、r>　　3.高氧會(huì)提高小鼠肺活化TGF-β1的含量，而對(duì)總TGF-β1的含量無影響，Elafin能夠抑制活化TGF-β1比例的升高，而不影響TGF-β1總蛋白的表達(dá)；模型組pSmad2表達(dá)以及pSmad2占總Smad2蛋白的比例均較空氣對(duì)照組顯著增加（P<0.05），給予Elafin后，兩者均顯著下降；與空氣對(duì)照組相比，模型組的tropoelastin，TTF-1以及HGF-3β表達(dá)顯著增加（P<0.01），而Elafin組tropoe

11、lastin，TTF-1以及HGF-3β表達(dá)顯著較模型降低（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.高氧暴露后，彈性蛋白的合成、組裝、沉積和降解等環(huán)節(jié)間的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致了彈性蛋白表達(dá)過度且沉積無序，擾亂了彈性蛋白在初級(jí)囊泡壁上的正確沉積從而阻礙次級(jí)分隔級(jí)的形成，進(jìn)而阻礙高氧暴露后的肺發(fā)育進(jìn)程。早產(chǎn)兒不完善的彈性蛋白系統(tǒng)參與了BPD的發(fā)生發(fā)展，并在其中起著非常重要的作用。
　　2.高氧致新生小鼠BPD發(fā)生的機(jī)制可能與NE表達(dá)與