Fam96B影響DNA損傷及細胞衰老的初步研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 細胞衰老的表型包括細胞核形態(tài)異常，細胞的增殖能力和DNA分子損傷修復(fù)能力減退等。核纖層和核纖層蛋白對于細胞核正常核形態(tài)的維持是至關(guān)重要的。核纖層蛋白結(jié)合蛋白的表達異常會使細胞增殖能力變慢和DNA損傷修復(fù)發(fā)生缺陷，與細胞衰老密切相關(guān)。在前期研究中，本課題組已經(jīng)證明Fam96B(Family with sequence similarity96, member B)蛋白又稱為MIP18，它與A型核纖層蛋白前體(

2、prelamin A)相互作用。也有研究報道，MMS19、XPD等DNA損傷修復(fù)蛋白與Fam96B在細胞質(zhì)中相互作用，參與DNA損傷修復(fù)。本文擬進一步探討Fam96B與細胞早老和復(fù)制性衰老的關(guān)系;Fam96B對維持細胞核形態(tài)和DNA損傷中的影響，以期揭示Fam96B在細胞衰老過程中的潛在分子機制。
　　 [方法]
　　 利用Western blotting技術(shù)檢測野生型(WT)和Zmpste24-/-的MEFs、年輕和衰

3、老的MEFs、健康個體和HGPS早老癥患者成纖維細胞中Fam96B的表達變化;通過構(gòu)建穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B表達的HEK293T細胞株為研究模型，采用EdU摻入法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞周期，DAPI染色觀察細胞核形態(tài);利用DN損傷誘導(dǎo)劑羥基脲（HU）處理HEK293T穩(wěn)定細胞株，使細胞發(fā)生DNA損傷，然后利用Western blotting技術(shù)檢測正常和穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B表達的HEK293T細胞γ-H2A.X的表達;利用W

4、estern blotting技術(shù)檢測細胞內(nèi)下調(diào)Fam96B的表達后，DN損傷修復(fù)相關(guān)蛋白MMS19和XPD的表達變化;利用siRNA沉默MEFs細胞中Fam96B的表達，Western blotting技術(shù)檢測細胞內(nèi)Fam96B和γ-H2A.X的表達，β-半乳糖苷酶染色檢測MEFs細胞衰老。
　　 [結(jié)果]
　　 1.Fam96B在WT和Zmpste24-/-MEFs中的蛋白表達無明顯差異。
　　 2.與年輕M

5、EFs細胞(P1)相比，F(xiàn)am96B在復(fù)制性衰老的MEFs(P9)中的蛋白表達顯著下調(diào)。
　　 3.與健康個體(F2-S)相比，F(xiàn)am96B在HGPS早老癥患者成纖維細胞中的蛋白表達下調(diào)。
　　 4.穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的表達對HEK293T細胞的細胞周期無顯著影響。
　　 5.與對照組相比，穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的表達后，HEK293T細胞的增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，核形態(tài)異常率也明顯增加(

6、5.3％ vs16.4％)。
　　 6.與對照組HEK293T細胞相比，HU處理細胞后，DN損傷檢測蛋白γ-H2AX在穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的HEK293T細胞株中表達上調(diào)。
　　 7.HEK293T細胞內(nèi)Fam96B的表達下調(diào)后，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白MMS19和XPD的表達均下調(diào)。
　　 8.沉默F(xiàn)am96B的表達可促進MEFs細胞DNA損傷和加速細胞衰老。
　　 [結(jié)論]
　　 在Zmpste