Fam96B影響DNA損傷及細(xì)胞衰老的初步研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 細(xì)胞衰老的表型包括細(xì)胞核形態(tài)異常，細(xì)胞的增殖能力和DNA分子損傷修復(fù)能力減退等。核纖層和核纖層蛋白對(duì)于細(xì)胞核正常核形態(tài)的維持是至關(guān)重要的。核纖層蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)異常會(huì)使細(xì)胞增殖能力變慢和DNA損傷修復(fù)發(fā)生缺陷，與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。在前期研究中，本課題組已經(jīng)證明Fam96B(Family with sequence similarity96, member B)蛋白又稱(chēng)為MIP18，它與A型核纖層蛋白前體(

2、prelamin A)相互作用。也有研究報(bào)道，MMS19、XPD等DNA損傷修復(fù)蛋白與Fam96B在細(xì)胞質(zhì)中相互作用，參與DNA損傷修復(fù)。本文擬進(jìn)一步探討Fam96B與細(xì)胞早老和復(fù)制性衰老的關(guān)系;Fam96B對(duì)維持細(xì)胞核形態(tài)和DNA損傷中的影響，以期揭示Fam96B在細(xì)胞衰老過(guò)程中的潛在分子機(jī)制。
　　 [方法]
　　 利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)野生型(WT)和Zmpste24-/-的MEFs、年輕和衰

3、老的MEFs、健康個(gè)體和HGPS早老癥患者成纖維細(xì)胞中Fam96B的表達(dá)變化;通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B表達(dá)的HEK293T細(xì)胞株為研究模型，采用EdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài);利用DN損傷誘導(dǎo)劑羥基脲（HU）處理HEK293T穩(wěn)定細(xì)胞株，使細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，然后利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)正常和穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B表達(dá)的HEK293T細(xì)胞γ-H2A.X的表達(dá);利用W

4、estern blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)下調(diào)Fam96B的表達(dá)后，DN損傷修復(fù)相關(guān)蛋白MMS19和XPD的表達(dá)變化;利用siRNA沉默MEFs細(xì)胞中Fam96B的表達(dá)，Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fam96B和γ-H2A.X的表達(dá)，β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)MEFs細(xì)胞衰老。
　　 [結(jié)果]
　　 1.Fam96B在WT和Zmpste24-/-MEFs中的蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 2.與年輕M

5、EFs細(xì)胞(P1)相比，F(xiàn)am96B在復(fù)制性衰老的MEFs(P9)中的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　 3.與健康個(gè)體(F2-S)相比，F(xiàn)am96B在HGPS早老癥患者成纖維細(xì)胞中的蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 4.穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的表達(dá)對(duì)HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。
　　 5.與對(duì)照組相比，穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的表達(dá)后，HEK293T細(xì)胞的增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，核形態(tài)異常率也明顯增加(

6、5.3％ vs16.4％)。
　　 6.與對(duì)照組HEK293T細(xì)胞相比，HU處理細(xì)胞后，DN損傷檢測(cè)蛋白γ-H2AX在穩(wěn)定沉默F(xiàn)am96B的HEK293T細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。
　　 7.HEK293T細(xì)胞內(nèi)Fam96B的表達(dá)下調(diào)后，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白MMS19和XPD的表達(dá)均下調(diào)。
　　 8.沉默F(xiàn)am96B的表達(dá)可促進(jìn)MEFs細(xì)胞DNA損傷和加速細(xì)胞衰老。
　　 [結(jié)論]
　　 在Zmpste