氰戊菊酯處理昆蟲細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化及誘導(dǎo)P450表達(dá)分子機(jī)理.pdf

1、細(xì)胞色素P450(CytochromeP450/CYP)包含了一個(gè)色素蛋白的超家族，在各種生物的異生物質(zhì)包括藥物、殺蟲劑，各種污染物，自然界中的毒素以及各種生物內(nèi)源物質(zhì)如維生素，甾類激素等的代謝中起中心作用。有機(jī)合成殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，使目前已有至少500種以上的昆蟲和螨類對(duì)一種或者多種殺蟲劑發(fā)展了抗性。氰戊菊酯((RS)-α-氨基-3-苯氧基芐基(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯，F(xiàn)envalerate)，是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯

2、類化學(xué)殺蟲劑，具有高效、低毒、低殘留的突出優(yōu)點(diǎn)，然而多年的實(shí)際應(yīng)用已使一些昆蟲對(duì)其產(chǎn)生了抗性。大量相關(guān)研究亦表明P450s是對(duì)菊酯類殺蟲劑發(fā)揮主要作用的酶類，但對(duì)P450作用的分子機(jī)制卻了解的較少。本研究通過(guò)氰戊菊酯處理昆蟲Trichoplusiani(Tn)細(xì)胞，采用化學(xué)檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)、及實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR等多種方法觀察處理過(guò)程中P450表達(dá)的變化及涉及的相關(guān)蛋白，對(duì)P450s的誘導(dǎo)作用機(jī)制及其與昆蟲抗藥性的關(guān)系做了有意義的探討，

3、本研究的結(jié)果對(duì)認(rèn)識(shí)P450s參與的殺蟲劑抗性的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和指導(dǎo)病媒防治具有重要意義。本研究獲得了以下試驗(yàn)結(jié)果： 1、以不同濃度梯度氰戊菊酯處理昆蟲細(xì)胞Tn，并用臺(tái)盼蘭染色，MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol)-2，5-diphenyltrazoliumbromide)還原試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，氰戊菊酯處理的濃度大于17.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞的死亡率升高到29.69％以上

4、，極顯著高于對(duì)照(P＜0.01)，細(xì)胞對(duì)MTT試劑的還原物吸光值降低，細(xì)胞的相對(duì)活力極顯著下降(P＜0.01)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果也證實(shí)，氰戊菊酯的濃度為25μmol/L時(shí)，死亡與凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照。因此確定了不影響細(xì)胞活力的濃度范圍為0-15μM。 2、在前面細(xì)胞活力試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置不影響細(xì)胞活力的氰戊菊酯濃度梯度處理Tn細(xì)胞12h，并以最適處理濃度-12.5μM氰戊菊酯分別處理Tn細(xì)胞0、3、6、9、12、24、

5、48h，提取微粒體，測(cè)定細(xì)胞中總P450s的含量。結(jié)果：P450s的含量隨氰戊菊酯濃度的增加而升高，并在氰戊菊酯濃度為12.5μM時(shí)達(dá)到最高(8.562nmol/mgprotein)，隨后下降；P450s的含量也隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，并在12h達(dá)到最高(5.28±1.14nmol/mgprotein)，隨后下降。因此，氰戊菊酯可誘導(dǎo)Tn細(xì)胞色素總P450s的變化，先隨濃度和處理時(shí)間增加到頂點(diǎn)后，過(guò)高的濃度和過(guò)長(zhǎng)的處理時(shí)間反而抑制P45

6、0的含量。在處理濃度為12.5μM，處理時(shí)間12h時(shí)細(xì)胞總P450含量最高。 3、為了揭示昆蟲中細(xì)胞色素P450對(duì)氰戊菊酯代謝的機(jī)制，我們用雙向電泳展示了氰戊菊酯處理前后昆蟲細(xì)胞系(Tn)細(xì)胞總蛋白中各種蛋白表達(dá)量的變化，并對(duì)表達(dá)變化的蛋白用質(zhì)譜測(cè)定的方法予以鑒定。結(jié)果顯示，用雙向電泳分離出Tn細(xì)胞的1300多個(gè)蛋白中，有33個(gè)表達(dá)發(fā)生了變化，其中8個(gè)下調(diào)，25個(gè)上調(diào)。通過(guò)質(zhì)譜鑒定，其中有3個(gè)細(xì)胞色素P450的同工酶表達(dá)上調(diào)，其

7、它蛋白可能與P450表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。 4、按鑒定出的3個(gè)P450基因序列設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增該基因的cDNA片段并用半定量方式對(duì)比氰戊菊酯處理前后表達(dá)量對(duì)比，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的一個(gè)P450CYP4L4在處理后的的cDNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。此片段被克隆并在GeneBank中登錄。用實(shí)時(shí)定量方式對(duì)用氰戊菊酯各種梯度濃度、及在固定濃度不同時(shí)間梯度處理下Tn細(xì)胞的CYP4L4在mRAN水平表達(dá)變化進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示

8、，這一變化與總的P450表達(dá)的模式相似。因此，氰戊菊酯可能通過(guò)已知的信號(hào)途徑誘導(dǎo)P450的表達(dá)，其中P450CYP4L4可能通過(guò)羥化的方式解毒氰戊菊酯。 5、通過(guò)二維液相色譜分離技術(shù)分析氰戊菊酯處理前后Tn細(xì)胞系蛋白質(zhì)譜的變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組與處理組于一維各收集了44個(gè)組分，再經(jīng)二維各收集了1980個(gè)組分，其中有134個(gè)差異組分，42個(gè)組分上調(diào)，82個(gè)組分下調(diào)，從中鑒定出真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及類似于負(fù)責(zé)果蠅嗅覺信號(hào)傳遞的穿膜受體。