抗氰戊菊酯棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP6B7和b-,5-基因在酵母中的異源表達(dá).pdf

1、細(xì)胞色素P450酶系代謝能力增強(qiáng)是害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因，而細(xì)胞色素b<,5>在P450介導(dǎo)的抗性中具有重要作用。其中可能與棉鈴蟲抗藥性相關(guān)的細(xì)胞色素P450基因主要有CYP4G8、CYP6B7等，但目前仍缺乏直接證據(jù)證明這些P450在抗藥性中的作用。將P450基因異源表達(dá)并測(cè)定P450蛋白對(duì)殺蟲劑的催化代謝能力及其代謝規(guī)律是直接的證明途徑之一。為了進(jìn)一步了解細(xì)胞色素P450 CYP6B7和細(xì)胞色素b<,5>基因與棉鈴蟲對(duì)擬除

2、蟲菊酯類殺蟲劑抗性之間的關(guān)系，本文進(jìn)行了抗氰戊菊酯棉鈴蟲細(xì)胞色素b<,5>基因的克隆，并檢測(cè)了該基因的表達(dá)，同時(shí)分別對(duì)細(xì)胞色素P450 CYP6B7和細(xì)胞色素b<,5>在畢赤酵母中的異源表達(dá)進(jìn)行了探索。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1) 根據(jù)已知細(xì)胞色素b5(AF061105)的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以抗氰戊菊酯棉鈴蟲六齡中期幼蟲的中腸組織總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，克隆獲得細(xì)胞色素b<,5>基因

3、編碼區(qū)序列。 2) 采用Northern雜交方法，檢測(cè)細(xì)胞色素b<,5> mRNA在敏感棉鈴蟲6齡幼蟲和抗氰戊菊酯4、5、6齡幼蟲中腸組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，抗性棉鈴蟲4齡期幼蟲的細(xì)胞色素b<,5>mRNA表達(dá)量高于5、6齡幼蟲，但抗性和敏感品系棉鈴蟲6齡幼蟲的b<,5> mRNA表達(dá)量沒有顯著差異。 3) 選用畢赤酵母系統(tǒng)對(duì)抗氰戊菊酯棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP687和細(xì)胞色素b<,5>基因進(jìn)行異源表達(dá)。根據(jù)巴斯德畢

4、赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K和CYP6B7及b<,5>序列的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游引物，獲得含有SnaB Ⅰ和Not Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的細(xì)胞色素CYP6B7和b<,5>基因序列。將雙酶切的細(xì)胞色素CYP6B7和b<,5>基因分別連接到經(jīng)過(guò)同樣處理的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K上，轉(zhuǎn)入TOP10，通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定，證明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pPIC9K-CYP6B7和pPIC9K-b<,5>。提取重組表達(dá)載體，以Sal Ⅰ線性化，