3T3中性紅攝取試驗方法在皮膚光毒性效應中的應用研究.pdf

1、光毒效應(phototoxicity)是指化學物質通過接觸、口服、注射等途徑進入體內，與一定照射劑量的光線或紫外線接觸后產生的皮膚毒性反應、遲發(fā)性免疫反應和致突變反應?？僧a生光毒性的化學物質很多，常見報道的多為一些藥物及功能性化妝品(特殊用途化妝品)原料如氯丙嗪、斯帕沙星、氟喹諾酮、噻嗪、酚噻嗪、磺胺、喹啉、鹽酸氯丙嗪、苯酮、六-甲基香豆素、三氯生、貫葉金絲桃提取物、某些香料如茉莉、肉桂、葵子麝香等。 目前國內外用于化學品光毒效

2、應安全性評價的試驗主要包括人體斑貼試驗(Humanskinpatchtest)、動物(豚鼠，兔及大鼠等)皮膚光照試驗(skinphotoxicitytest)和體外試驗(invitrotest)。人體斑貼實驗的結果真實，能較理想評價化學物質對人體的光毒效應，但存在樣本難得、人群依從性和倫理學問題；動物試驗操作簡單，方法成熟，但將動物試驗結果外推到人存在種群差異，并且對動物存在一定的傷害，自本世紀初以來受到了動物保護組織和一些科研工作者的

3、抨擊；而體外試驗有證據表明其結果與體內試驗的相關性也較好，同時又不存在體內試驗有關的倫理問題，且費用相對較低，因此近年來，隨著社會文明的進步、科學技術的發(fā)展以及世界上一些動物保護組織施加的社會壓力等方面原因，歐、美、日等發(fā)達工業(yè)國家化妝品安全性評價已趨向于向“3R原則(替代、減少、優(yōu)化)”轉化，采用體外方法替代體內實驗進行皮膚光毒安全性評價已成為毒理學安全性評價領域迫切需要解決的熱點問題。 研究目的:引進并建立3T3中性紅攝取光

4、毒試驗的體外試驗方法，通過對已知化學物質和化妝品光毒性檢測的應用與比較，初步評價該實驗方法在我國化妝品和化學日用品安全性評價工作中實際應用的可能性，為制訂和完善新的標準與規(guī)范提供依據。 材料與方法: 1.使用3T3細胞進行中性紅攝取體外光毒性試驗并與與已知的光毒性陽性數據 庫進行比較參照OECD的數據庫(1999)，選擇24種已知光毒性的化學物質作為受試物，包括6-甲基香豆素、8-甲氧補骨脂素、胺碘酮、蒽、硫氯酚

5、、鹽酸氯丙嗪、氯丙嗪、去甲金霉素、鹽酸去甲金霉素、酮洛芬、葵子麝香、中性紅、諾氟沙星、異丙嗪、鹽酸異丙嗪等15種光毒陽性物質；月桂硫酸鈉、二苯甲酮、鹽酸洗必太、六氯酚、L-組氨酸、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、P-氨基苯甲酸、盤尼西林等9種光毒陰性物質，使用Balb/c3T3細胞進行中性紅攝取體外光毒性試驗并將結果與已知的光毒性陽性數據庫進行比較，同時選擇小部分陽性物質進行動物試驗。 1)細胞染毒 ①復蘇后經培養(yǎng)生長良好

6、的3T3細胞，計數并準備為1×105/ml的細胞懸液。于96孔培養(yǎng)板(外圍一圈除外)中每孔加入100μl細胞懸液(=1×104細胞/孔)。每個受試物，準備兩個平板：一個用于確定細胞毒性(-UVA)，而另一個用于確定光毒性(+UVA)。 ②細胞培養(yǎng)24小時(7.5％CO2，37℃)，形成半融合單層細胞。 ③棄去培養(yǎng)液，用150μl的EBSS/PBS沖洗兩次。添加100μl溶有適當濃度的受試物EBSS/PBS。培養(yǎng)細胞1小時

7、(7.5％CO2，37℃)。96孔板的外圍孔為空白試劑對照，第2、11行為陰性對照，3-10行分八個劑量組進行染毒。 ④+UVA測定：在室溫下以1.7mW/cm2光強度透過96孔板蓋照射細胞10分鐘。室溫下，將同樣的平板(-UVA)置于暗處同+UVA暴露時間。 ⑤棄去受試溶，用150μl的EBSS/PBS沖洗兩次。換新培養(yǎng)液37℃，7.5％CO2培養(yǎng)過夜。 ⑥次日在相差顯微鏡下檢查細胞。記錄受試物細胞毒性所致細胞

8、形態(tài)學的改變。 2)中性紅吸收(NRU)測量 ①用150μl預先加溫的EBSS/PBS沖洗細胞。添加100μl的中性紅(NR)培養(yǎng)液，37℃，7.5％CO2，濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細胞3小時。 ②吸棄NR培養(yǎng)液，用150μ1EBSS/PBS沖洗細胞。 ③棄去全部的EBSS/PBS。 ④添加150μl的NR(1％冰醋酸+50％乙醇+49％H2O)提取溶液，在微量滴定平板振蕩器上迅速震蕩微量滴定平板10

9、分鐘，直至NR已從細胞內被提取出來并形成均質的溶液。 ⑤酶標儀測量溶液在540nm波長處的光密度。以標準ASCII格式保存數據文件，隨后以Photo32軟件進行PIF及MPE分析。判斷標準為：如果PIF＜5：預測無潛在光毒性；如果PIF＞5：預測有潛在光毒性。 如果MPE＜0.1：預測無潛在光毒性；如果MPE＞.01：預測有潛在光毒性。與已知的化學物質光毒性數據庫進行比較。 2.使用部分特殊用途化妝品進行中性紅攝

10、取體外光毒性試驗、并對應使用成年白化豚鼠進行傳統(tǒng)的整體動物光毒性試驗，比較分析兩種試驗的結果選擇千葉防曬霜、剔透雙重美白防曬露等二十種防曬、祛斑、育發(fā)類特殊用途化妝品，進行中性紅攝取體外光毒性試驗的同時，使用成年白化豚鼠進行動物光毒性試驗，將兩者的結果進行統(tǒng)計學比較分析。 3T3細胞的光毒性試驗同上。整體動物的光毒性試驗步驟如下： ①試驗前18h～24h，將動物脊柱兩側皮膚去毛，試驗部位皮膚需完好，無損傷及異常。備4塊去

11、毛區(qū)(左右各2，相向排列)，每塊去毛面積約為2cm×2cm。 ②將動物固定，在動物去毛區(qū)上兩區(qū)涂敷0.2mL(g)受試物，下兩區(qū)為空白對照。30min后，左側用鋁箔復蓋，膠帶固定，右側用UVA進行照射。 ③結束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應，根據我國的“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”中相關試驗判定標準，判定每只動物皮膚反應評分。 對兩種試驗方法所獲得的結果進行體內試驗與體外試驗的一致性比較，以確定兩種方法有無差異。

12、并計算靈敏度(真陽性率，TPR)，特異度(Spe)，陽性預測價值(PV+)，陰性預測價值(PV-)，假陽性率(FPR)，陽性似然比(LR+)及Youden指數、Kappa指數等，并進行分析比較。 試驗結果: 1.已知其光毒性的24種(15陽9陰)化學物質的3T3細胞中性紅攝取體外光毒性試驗結果如下：24種已知光毒性的受試物，包括6-甲基香豆素、8-甲氧補骨脂素、胺碘酮、蒽、硫氯酚、鹽酸氯丙嗪、氯丙嗪、去甲金霉素、鹽酸去甲

13、金霉素、酮洛芬、葵子麝香、中性紅、諾氟沙星、異丙嗪、鹽酸異丙嗪等15種光毒陽性物質；月桂硫酸鈉、二苯甲酮、鹽酸洗必太、六氯酚、L-組氨酸、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、P-氨基苯甲酸、盤尼西林等9種光毒陰性物質，使用Balb/c3T3細胞進行中性紅攝取體外光毒性試驗結果為，15個陽性物質中測出除胺碘酮外，有14個呈現陽性反應，9個陰性物質均為陰性反應。 無論以PIF或MPE作判斷標準，其靈敏度(TPR)均為93.3％，特異度(S

14、pe)為100％，陽性預測價值(PV+)為1，陰性預測價值(PV-)為0.9，假陽性率(FPR)為6.7％，陽性似然比(LR+)為13.93，Youden指數(J)為0.866，Kappa指數k為0.91，均十分接近1。 2.部分特殊用途化妝品同時進行中性紅攝取體外光毒性試驗及傳統(tǒng)的整體動物光毒性試驗，兩種試驗的結果如下：本次研究中的20種化妝品終產品，整體動物光毒性試驗結果均為陰性。不論是基于PIF還是基于MPE的3T3細胞光

15、毒性試驗，所測定的結果也均為陰性，與動物試驗結果完全相同。 以上兩部分試驗結果表明，本實驗室中建立的3T3細胞光毒性試驗方法，已經與動物實驗方法基本一致。 結論: 1.本研究在我國率先成功建立了用于光毒性試驗的體外替代方法——3T3中性紅攝取試驗。 2.與整體動物光毒性試驗結果比較，陽性物、陰性物和實測的化妝品在體外試驗方法中均有較高的一致性和良好的結果再現性。 3.3T3中性紅攝取試驗快速、靈敏