肺癌干細(xì)胞脊柱轉(zhuǎn)移裸鼠模型的建立及相關(guān)研究.pdf

1、研究目的：
　　 目前，隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，不可避免的的環(huán)境污染的加重；大量使用農(nóng)藥造成糧食、蔬菜、水果的污染以及食品添加劑的使用；醫(yī)療水平提高、經(jīng)濟(jì)條件的改善；平均壽命的延長(zhǎng)；不良情緒和不良生活習(xí)慣等諸多因素使腫瘤發(fā)病率不斷升高，腫瘤已成為威脅人類健康的重要疾病。每年約有265萬人最后失去生命就是因?yàn)轭净寄[瘤及腫瘤相關(guān)并發(fā)癥。近年來，國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)相關(guān)工作者越來越重視對(duì)腫瘤及其并發(fā)癥的的研究，同時(shí)對(duì)腫瘤的診斷、治療包括內(nèi)外科的治療

2、以及放化療等治療的結(jié)合取得了巨大的進(jìn)步，肺癌、肝癌、乳腺癌包括一些原發(fā)性惡性腫瘤的生存期及預(yù)后還是較差，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移等機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足是腫瘤治療預(yù)后不理想的主要原因，臨床上缺乏有效的治療手段。
　　 我國(guó)衛(wèi)生部屬下腫瘤防治辦公室曾做過這樣的統(tǒng)計(jì)：我國(guó)腫瘤發(fā)病率排序中，肺癌、乳腺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發(fā)病首位，而肺癌則是所有惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤。有學(xué)者在臨床中發(fā)現(xiàn)，對(duì)死亡的肺癌患者進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)高達(dá)90％的肺癌死亡患

3、者已經(jīng)有脊柱轉(zhuǎn)移。肺癌以及肺癌脊柱轉(zhuǎn)移瘤惡性程度非常高，生長(zhǎng)迅速，侵襲性非常強(qiáng)，發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移早，肺癌患者生存期預(yù)期差，生活質(zhì)量差，5年生存率低。國(guó)內(nèi)外對(duì)肺癌的治療是在外科治療的基礎(chǔ)上，結(jié)合化療、放療和免疫治療等措施，治療措施相對(duì)規(guī)范和統(tǒng)一。目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的一個(gè)挑戰(zhàn)性難題就是怎樣對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤進(jìn)行有效的治療，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移性脊柱腫瘤患者的治療理念已由消極的對(duì)癥處理向以外科治療為主，結(jié)合放療、化療等綜合治療為輔的積極治療措施轉(zhuǎn)

4、變，使患者的脊髓神經(jīng)功能得以改善，生活質(zhì)量有了顯著的提高。但仍很難阻止肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制目前很難解釋，而腫瘤干細(xì)胞理論的提出則為其提供了很好的解決思路。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為僅有極少數(shù)腫瘤細(xì)胞(即腫瘤干細(xì)胞)而非全部腫瘤細(xì)胞具有致瘤性。腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞一樣多處于靜止期，與大多數(shù)快速增殖的腫瘤細(xì)胞不同，常規(guī)放、化療都不易殺到它，即使殺死絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，但只要有甚至只需要極少量的的腫瘤干細(xì)胞沒被殺死，腫瘤的復(fù)

5、發(fā)則肯定存在。這一理論很好地解釋了眾多骨腫瘤醫(yī)師對(duì)肺癌脊柱轉(zhuǎn)移長(zhǎng)期療效較差的臨床困惑。
　　 本研究針對(duì)肺癌脊柱轉(zhuǎn)移特性，選取肺癌細(xì)胞株A549分離獲得腫瘤干細(xì)胞，并進(jìn)行干細(xì)胞的鑒定，以此為基礎(chǔ)建立肺癌干細(xì)胞裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移模型，為進(jìn)一步研究肺癌脊柱轉(zhuǎn)移機(jī)制、早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 選用肺癌細(xì)胞株A549，傳代培養(yǎng)采用添加生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)肺癌球體細(xì)胞；應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)腫瘤

6、球體細(xì)胞中蛋白Sox2，Nanog及Oct4的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞球；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體細(xì)胞中CD133標(biāo)志的表達(dá)；免疫磁珠法以CD133為標(biāo)志分選腫瘤干細(xì)胞。最后將分選所得腫瘤干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，采用左心室注射法，從而建立基于干細(xì)胞理論的肺癌干細(xì)胞裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移模型。
　　 結(jié)果：
　　 1、肺癌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，加入生長(zhǎng)因子，成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞球體形成；
　　 2、應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)肺癌球體細(xì)胞中Sox

7、2，Nanog及Oct4蛋白的表達(dá)，Sox2，Nanog及Oct4蛋白在多數(shù)細(xì)胞中陽性表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌脊柱轉(zhuǎn)移瘤球體細(xì)胞中CD133的表達(dá)。
　　 3、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲性、增殖能力，能夠在小鼠體內(nèi)成瘤。
　　 4、免疫磁珠法以CD133為標(biāo)志分選肺癌干細(xì)胞，經(jīng)左心室注射成功建立肺癌裸鼠脊柱轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)研究。
　　 結(jié)論：
　　

8、 利用普通細(xì)胞株細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF、TGF-β1、bFGF等能成功誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞球體細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)表明：Sox2，Nanog及Oct4蛋白在該細(xì)胞中多數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CD133可以作為肺癌干細(xì)胞重要的表面標(biāo)志，基于以上原理，應(yīng)用免疫磁珠法分選出其中的CD133+細(xì)胞，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CD133+細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲性、增殖能力，能夠在小鼠體內(nèi)成瘤。肺癌干細(xì)胞分