共聚集顯微內(nèi)鏡在體診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變和胃癌分子成像的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 目前胃癌仍是世界上病死率排名第二位的惡性腫瘤。1988年，Correa提出的慢性萎縮性胃炎-胃黏膜腸上皮化生-胃黏膜不典型增生-腸型胃癌的多階段胃癌發(fā)展模型已被較多臨床隨訪研究、胃癌手術切除標本及基礎實驗等所驗證。故萎縮性胃炎、胃黏膜腸上皮化生及不典型增生(Dysplasia)均為公認的胃黏膜癌前病變。盡管如此，胃黏膜不典型增生作為腸型胃癌形成的倒數(shù)第二步演變步驟，是胃腺癌最為直接的癌前病變，其早期診斷對防治

2、胃癌具有十分重要的臨床意義。2010年，世界衛(wèi)生組織正式提出用“上皮內(nèi)瘤變(IntraepithelialNeoplasia)”取代“不典型增生”。
　　 內(nèi)鏡檢查是早期發(fā)現(xiàn)胃黏膜瘤變的最有效手段。尤其是近年來應用于臨床的先進的內(nèi)鏡技術如高清晰內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、色素內(nèi)鏡及窄帶成像(Narrow-bandImaging，NBI)等，均可提供胃黏膜表面顏色及細微結(jié)構變化的高清晰圖像。然而，早期胃黏膜瘤變的內(nèi)鏡下宏觀改變?nèi)狈μ禺愋?，故雖

3、然上述內(nèi)鏡技術可以一定程度提高早期胃癌的檢出率，但仍無法觀察到胃黏膜上皮細胞、腺體和微血管等顯微結(jié)構的改變。因此，為確診病變，內(nèi)鏡醫(yī)師仍需留取多塊活檢標本，由此造成的活檢瘢痕對胃黏膜上皮內(nèi)瘤變(GastricIntraepithelialNeoplasia,GIN)患者短期內(nèi)實行內(nèi)鏡治療亦有諸多不良影響。此外，活檢標本的組織病理學檢查需耗費2-3天時間，對于確診為高級別上皮內(nèi)瘤變（High-gradeIntraepithelialNeo

4、plasia,HGIN）和早期胃癌的患者來說，不但有可能延誤治療時機，而且增加了患者的精神與經(jīng)濟負擔。
　　 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(ConfocalLaserEndomicroscopy，CLE)是一種新型的內(nèi)鏡技術，可以在白光內(nèi)鏡觀察的同時，通過靜脈注射或黏膜表面噴灑熒光造影劑，實時觀察消化道黏膜上皮細胞、腺體及血管等顯微結(jié)構，獲取類似病理組織學的顯微內(nèi)鏡圖像。CLE的問世為胃黏膜癌前病變及早期胃癌的診斷提供了新的有力工具。然而

5、，目前尚無研究將其應用于胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的診斷。
　　 早期診斷是改善胃癌患者預后的關鍵。內(nèi)鏡活檢雖為目前公認的診斷胃癌的金標準，但仍存在致使病變形態(tài)改變、引發(fā)出血、穿孔等并發(fā)癥的潛在缺陷。此外，常規(guī)內(nèi)鏡活檢的病理組織學確診病變后再行內(nèi)鏡下治療還會延后治療時間，增添患者的心理和醫(yī)療負擔。因此，目前亟需一種能夠?qū)崿F(xiàn)實時顯微組織觀察的內(nèi)鏡技術，使醫(yī)師在普通內(nèi)鏡檢查的同時觀察到病變的顯微結(jié)構改變并立即做出診斷，采取相應的治療措施，從而

6、提高胃癌的檢出率和診斷、治療水平。近年來，已有多項研究致力于將CLE應用于在體診斷胃癌;研究結(jié)果顯示，根據(jù)已制定的CLE形態(tài)學診斷標準，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠較為準確的鑒別胃黏膜癌變病變與非癌變病變。但上述研究均采用對患者靜脈注射熒光素鈉作為對比劑，獲取胃黏膜顯微結(jié)構的非特異性熒光成像，無法達到對胃腸道黏膜疾病功能性和分子水平改變進行觀察的目的。近期幾項研究表明，利用熒光物質(zhì)標記的特異性抗體，CLE能夠?qū)崿F(xiàn)活體內(nèi)分子水平的觀察。

7、　　 因此，本課題擬圍繞胃黏膜上皮內(nèi)瘤變和胃癌的顯微內(nèi)鏡診斷方面展開研究，主要研究目的為:(1)探討利用CLE對胃黏膜非瘤變和瘤變病變進行鑒別診斷的可行性，前瞻性評估CLE對胃黏膜上皮內(nèi)瘤變進行實時診斷和分級診斷的效能;(2)系統(tǒng)研究CLE對胃癌活體分子成像的可行性。
　　 方法：
　　 第一部分:共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的可行性研究
　　 研究過程分為兩個階段，第一階段采用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡

8、對已知正常胃黏膜、非瘤變和胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的病變進行檢查，將所掃描部位的共聚焦激光顯微內(nèi)鏡圖像與相應部位橫切面的組織病理學圖像進行對比，制定共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對胃黏膜病變的鑒別診斷標準和GIN分級診斷的標準體系。第二階段，前瞻性的納入2009年7月至2010年1月間于齊魯醫(yī)院胃鏡室預約行CLE檢查且符合相應納入標準的患者為研究對象。由CLE操作者對胃黏膜病變進行實時CLE診斷;由另外一名未參與實時診斷的有經(jīng)驗的內(nèi)鏡醫(yī)師在檢查結(jié)束后對所留

9、取的圖片進行盲法診斷。以病理組織學診斷結(jié)果為金標準，驗證上述診斷標準。為了評估觀察者間和觀察者內(nèi)的一致性，我們還邀請了3名內(nèi)鏡醫(yī)師和1名病理醫(yī)師獨立地對前瞻性研究中的50處病變的共聚焦圖像按本研究制定的診斷標準進行分類診斷。其中一名內(nèi)鏡醫(yī)師間隔一周后再次對這50處病變的CLE圖像進行診斷。
　　 第二部分:共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對胃癌活體分子成像的研究
　　 研究分為3個步驟，分別為細胞學研究、胃癌荷瘤鼠動物模型體內(nèi)分子成像

10、和人體新鮮組織體外研究。
　　 (1)將BGC823和SGC7901這2種人源性胃癌細胞系分別與AF488-MG7抗體，同型對照抗體，或PBS體外共孵育，首先進行流式細胞儀分析，然后利用CLE（FIVE1，Optiscan）對未固定的活細胞進行顯微熒光成像，熒光顯微鏡觀察;最后進行MG7抗原細胞學免疫組織化學染色。
　　 (2)建立上述兩種胃癌細胞系的荷瘤鼠動物模型，心內(nèi)注射AF680-MG7抗體或AF680-同型對照抗

11、體，利用小動物活體成像系統(tǒng)(Kodak2000MM，Kodak，USA)對其進行整體動態(tài)觀察，總結(jié)腫瘤特異性熒光成像的最佳抗體劑量及時間。然后根據(jù)上述結(jié)果進行CLE荷瘤鼠體內(nèi)顯微水平的分子成像。對CLE觀察部位的組織進行MG7抗原免疫組織化學染色，以相同荷瘤鼠的肝臟組織為陰性對照。
　　 (3)選取新鮮胃癌組織及相同患者的非癌組織的手術標本(5～10mm)或內(nèi)鏡活檢標本為研究對象，與AF488-MG7抗體溶液共孵育，然后立即用C

12、LE(FIVE1，Optiscan)進行觀察。全部CLE操作均由同一研究者完成，該研究者在進行CLE觀察時不知曉標本的病理組織學診斷和位置來源。將CLE圖像利用半定量方法分為陰性(0)，弱陽性(+)，陽性(++)和強陽性（+++）4個等級，由另外3位有經(jīng)驗的CLE研究者分別盲法獨立對CLE圖片進行半定量分析，從而評估該CLE分子成像半定量評估體系的可靠性。CLE掃描結(jié)束后將標本行HE染色和MG7抗原免疫組化實驗。以病理組織學診斷作為本實

13、驗的金標準。對所得實驗結(jié)果利用Spearman相關系數(shù)評估CLE半定量結(jié)果與相應的免疫組化半定量結(jié)果的相關性。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:
　　 前瞻性研究共納入75例患者，包括91處可見病變，留取CLE圖像15093張。利用本研究中制定的CLE胃黏膜病變鑒別診斷標準，CLE最終診斷GIN的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比和陰性似然比分別為77.8％(95％CI,63.7％-87.5％),8

14、1.8％(95％CI,68.0％-90.5％),81.4％(95％CI,67.4％-90.3％),78.3％(95％CI,64.4％-87.7％),4.28(95％CI,2.24-8.16)和0.27(95％CI，0.16-0.48)。CLE實時診斷與最終診斷的準確度比較無統(tǒng)計學差異(P=0.549)。
　　 觀察者間一致性的平均Kappa值為0.70（內(nèi)鏡醫(yī)師之間）和0.71（內(nèi)鏡醫(yī)師與病理醫(yī)師之間）。觀察者內(nèi)一致性亦較高（k

15、appa=0.78）。上皮內(nèi)瘤變評分≥5用于區(qū)分高級別和低級別上皮內(nèi)瘤變的靈敏度和特異度分別為66.7％和88.0％。
　　 第二部分:
　　 (1)流式細胞術檢測結(jié)果顯示本研究中所使用的BGC823和SGC7901胃癌細胞系均存在MG7-Ag的表達;CLE(FIVE1，Optiscan)圖像顯示細胞膜和胞漿的特異性熒光信號;即刻臺式熒光顯微鏡觀察結(jié)果與CLE相似。細胞免疫組化結(jié)果也驗證了上述兩種細胞系的細胞膜和胞漿中存

16、在MG7-Ag的表達。
　　 (2)荷瘤鼠整體動態(tài)熒光成像觀察結(jié)果顯示，心內(nèi)注射AF680-MG7抗體（1μg/g體重）避光飼養(yǎng)24小時后，小動物活體成像儀攝取的圖像中即可見腫瘤部位出現(xiàn)特異性熒光信號。該腫瘤部位的特異性熒光信號在48小時達最強。CLE觀察腫瘤表面均可見特異性熒光信號;體外免疫組化結(jié)果和臺式熒光顯微鏡觀察冰凍切片的圖像與體內(nèi)CLE圖像相似。
　　 (3)共前瞻性納入了46例新鮮的人組織標本，包括18例手術

17、標本和28例內(nèi)鏡活檢標本（來自23例胃癌患者）。23例胃癌組織標本中有22例在CLE實驗中觀察到了特異性熒光信號（+～+++），而非癌組織標本則無或僅有弱熒光信號(0或+，n=18，n=5)。CLE半定量分析結(jié)果與不同等級的免疫組化結(jié)果的相關性較好（Spearmanr=0.87，P＜0.001）。CLE圖像半定量分析方法的觀察者間一致性較高(ICC=0.883，95％可信區(qū)間:0.819～0.929)。
　　 結(jié)論：
　　

18、 1.通過識別共聚焦顯微圖像中腺體結(jié)構、細胞形態(tài)和血管結(jié)構的特征性改變，可以區(qū)分正常胃黏膜、非瘤變病變及胃黏膜上皮內(nèi)瘤變病變。
　　 2.通過制定共聚焦顯微圖像瘤變改變的評分系統(tǒng)，可初步區(qū)分低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變。
　　 3.CLE診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的觀察者間和觀察者內(nèi)一致性較高，具有較好的可靠性。
　　 4.利用熒光標記的MG7抗體，CLE可以對胃癌荷瘤鼠進行活體內(nèi)顯微水平的靶向分子成像;CLE對胃癌患者

19、的新鮮黏膜組織體外熒光分子成像的結(jié)果與傳統(tǒng)的體外免疫組織化學染色結(jié)果相關性好。
　　 研究意義：
　　 本研究證實CLE可清晰識別GIN特征性的細胞異常、結(jié)構紊亂和微血管變化，建立的CLE下胃黏膜病變的診斷標準可實時區(qū)分GIN病變與非瘤變病變。CLE對GIN的分類診斷標準的觀察者間及觀察者內(nèi)一致性均較高，說明該診斷標準的可靠性較好。利用CLE圖像中GIN的改變的嚴重程度的差異可以對GIN進行分級診斷，高特異度的實時鑒別診

20、斷HGIN病變，從而使內(nèi)鏡醫(yī)師對病變部位即刻進行內(nèi)鏡下治療，避免治療時機的延誤、活檢疤痕對內(nèi)鏡治療的不良影響以及醫(yī)療資源的重復消耗。本研究首次利用熒光標記的MG7抗體，以CLE為觀察手段，實現(xiàn)了對胃癌荷瘤鼠的活體內(nèi)靶向分子成像和人體活組織的體外分子成像。CLE作為一種新的在體顯微分子成像技術，有助于提高胃癌的診斷效能，準確篩選MG7-Ag陽性的患者。盡管該項技術的臨床價值尚待進一步人體內(nèi)研究的驗證，我們目前的研究結(jié)果已初步確定了CLE輔