共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變診斷和胃癌分子成像中的研究.pdf

1、背景與目的:
　　我國是胃癌及其癌前病變高發(fā)的國家，形勢嚴峻。胃腸道內(nèi)窺鏡檢查是早期發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變的最直接有效的手段。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Confocal LaserEndomicroscopy，CLE)形態(tài)成像功能和分子成像功能，使其在診斷胃癌及其癌前病變中具有獨特的優(yōu)勢，然而目前研究數(shù)據(jù)有限。本研究旨在通過分析探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Probe-based CLE，pCLE)在診斷萎縮性胃炎(Atrophic Gastrit

2、is，AG)、胃黏膜腸上皮化生（Gastric Intestinal Metaplasia，GIM）及其亞型、低級別上皮內(nèi)瘤變(Low-grade Intraepithelial Neoplasia，LGIN)和高級別上皮內(nèi)瘤變(High-grade Intraepithelial Neoplasia，HGIN)中的效能，以及通過以熒光基團標記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE鑒別HER2過表達的胃癌細胞株和胃癌荷瘤鼠等一系列研

3、究，來闡明pCLE在胃癌及癌前病變中的形態(tài)成像和分子成像作用。
　　方法:
　　1.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變診斷中的作用本研究收集了2013年12月至2014年11月于浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院行上消化道pCLE檢查的患者資料，由兩名具有三年以上pCLE讀片經(jīng)驗的內(nèi)鏡醫(yī)師回顧性閱讀每一位患者的pCLE保存錄像，并以以下標準做出pCLE診斷。以“胃小凹數(shù)目減少、胃小凹開口擴張”作為AG的pCLE下診斷標準，以“觀察到

4、杯狀細胞、柱狀吸收細胞、紋狀緣或絨毛狀上皮”作為GIM的pCLE下診斷標準，以“輕、中度異型胃小凹結(jié)構(gòu)（胃小凹寬度和上皮層厚度大小不一），微血管管徑增大，不同程度的熒光素鈉外滲，形態(tài)扭曲”作為LGIN的pCLE下診斷標準，以“胃小凹結(jié)構(gòu)明顯異型（上皮層明顯形態(tài)改變）或無明顯腺體結(jié)構(gòu)，微血管形態(tài)不規(guī)則，管徑增大，數(shù)目增多”作為HGIN的pCLE下診斷標準，以病理診斷作為金標準，統(tǒng)計分析pCLE診斷AG、GIM、LGIN、HGIN的靈敏度、

5、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、約登指數(shù)及相應(yīng)95％置信區(qū)間(confident interval，CI)和符合率及κ值。此外，以“具有完整紋狀緣的非分泌吸收細胞和散在分布的杯狀細胞”作為完全型GIM的pCLE下診斷標準，以“胃黏膜上皮細胞和散在分布的杯狀細胞，或由高柱狀細胞和散在分布的杯狀細胞排列而成的迂曲分支狀胃小凹開口形態(tài)，且不可觀察到紋狀緣”作為不完全型GIM的pCLE下診斷標準，與HE染色診斷（新悉尼系

6、統(tǒng)標準）進行比對，統(tǒng)計分析pCLE診斷不同亞型GIM與HE染色診斷的一致性。
　　2.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌分子成像中的研究主要包括細胞實驗和動物實驗。通過蛋白印跡實驗檢測兩株人胃癌細胞系MGC-803和NCI-N87中HER2表達量情況;通過流式細胞術(shù)和細胞免疫熒光實驗檢測熒光基團標記的抗HER2抗體作為分子探針是否可特異性結(jié)合到HER2高表達的細胞系上;通過細胞增殖-毒性檢測實驗檢測實驗所用濃度的抗HER2抗體和對照抗體對細

7、胞毒性有無差異;通過構(gòu)建荷瘤鼠模型以及在荷瘤鼠模型上進行的活體熒光實驗、pCLE成像實驗，由兩位富有經(jīng)驗的pCLE內(nèi)鏡醫(yī)師對pCLE成像結(jié)果進行半定量化，即分級為-、+、2+、3+、4+，并進行皮下瘤和肝臟的HE染色及免疫組化實驗，檢測以熒光基團標記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE是否可以鑒別出HER2高表達的荷瘤鼠。
　　結(jié)果:
　　1.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變診斷中的作用研究共納入55例患者，以胃黏膜

8、病變例數(shù)為基礎(chǔ)，共計80個胃黏膜病變。以病理組織學診斷結(jié)果為金標準，pCLE診斷AG的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為81.25％(95％CI，53.69％-95.03％)、98.44％(95％CI，90.46％-99.92％)，符合率為95.00％，κ值為0.84; pCLE診斷GIM的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為93.22％(95％CI，82.73％-97.81％)、90.48％(95％CI，68.17％-98.33％)

9、，符合率為92.50％，κ值為0.81; pCLE和HE染色診斷完全型GIM的符合率為0.75，κ值為0.49，診斷不完全型GIM的符合率為0.79，κ值為0.48; pCLE診斷LGIN（金標準:病理診斷為輕度、中度或輕中度異型增生）的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為82.35％(95％CI，55.80％-95.33％)、88.89％(95％CI，77.84％-95.04％)，符合率為87.50％，κ值為0.66; pCLE診斷H

10、GIN（金標準:病理診斷為重度異型增生或胃癌）的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為95.65％（95％CI，76.03％-99.77％）、98.25％(95％CI，89.37％-99.91％)，符合率為97.50％，κ值為0.94。
　　2.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌分子成像中的研究蛋白印跡實驗結(jié)果為MGC-803低表達HER2，而NCI-N87高表達HER2;流式細胞術(shù)和細胞免疫熒光實驗結(jié)果為熒光基團標記的抗HER2抗體作為分子

11、探針可以特異性結(jié)合到HER2高表達的細胞系上;細胞增殖-毒性檢測實驗結(jié)果提示實驗用抗體濃度實驗組和對照組對細胞毒性相近，不影響實驗結(jié)果的解讀;MGC-803荷瘤鼠和NCI-N87荷瘤鼠構(gòu)建成功，活體熒光成像實驗結(jié)果表明每只荷瘤鼠尾靜脈注射4μg熒光基團標記的抗HER2抗體、避光飼養(yǎng)24小時可清楚觀測到皮下瘤熒光量間的差異;pCLE成像實驗半定量化結(jié)果為NCI-N87荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標記的抗HER2抗體中的8只為3+或4+，1只2+，

12、尾靜脈注射熒光標記的對照抗體均在2+及以下，免疫組化結(jié)果均為HER2過表達;MGC-803荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標記的抗HER2抗體中有3只為4+，免疫組化結(jié)果也均為HER2過表達，其余5只為2+及以下，免疫組化結(jié)果為其中1只為HER2過表達;MGC-803荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標記的對照抗體均在2+及以下，免疫組化結(jié)果均為HER2低表達。
　　結(jié)論:
　　pCLE可用于診斷AG、GIM、LGIN、HGIN，并可對GIM進行初步

13、分型診斷。
　　以熒光基團標記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE的分子成像功能，可以很好地鑒別出HER2過表達的胃癌細胞和荷瘤鼠。
　　意義:
　　本研究結(jié)果表明pCLE可用于診斷AG、GIM、LGIN、HGIN以及對GIM進行初步分型診斷，為pCLE的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，并可以指導內(nèi)鏡醫(yī)師利用pCLE診斷結(jié)果進行靶向活檢，以提高檢出率，降低漏診率。
　　本研究通過細胞系和動物模型實驗首次闡明了pCLE