共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對(duì)結(jié)腸粘膜損傷的形態(tài)和功能診斷.pdf

1、背景和目的：
　　 腸粘膜屏障是由包括腸上皮細(xì)胞、細(xì)胞間連接及分泌性屏障所組成的結(jié)構(gòu),在維護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮重要作用。腸粘膜屏障損傷是包括炎癥性腸病、乳糜瀉在內(nèi)的多種胃腸道疾病的重要發(fā)病機(jī)制。近些年來,一度被認(rèn)為缺少器質(zhì)性改變依據(jù)的功能性胃腸病,如腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制也被認(rèn)為和腸粘膜屏障受損有關(guān)。
　　 對(duì)腸粘膜屏障損傷的研究離不開內(nèi)窺鏡檢查和腸粘膜通透性的檢測。而當(dāng)前常規(guī)的白光內(nèi)鏡對(duì)隱匿性的活動(dòng)性炎癥診斷

2、欠敏感,有報(bào)道顯示普通白光內(nèi)鏡下表現(xiàn)為正常的患者,約30％經(jīng)病理活檢提示相當(dāng)部分仍殘留有急性活動(dòng)性炎癥,而這種隱匿性的急性炎癥往往是炎癥性腸病患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素；腸粘膜通透性檢測方面:目前的檢測方法大體分為侵入性和非侵入性兩種。前者如Ussing灌流室,需要對(duì)腸粘膜進(jìn)行多塊的活檢,并且需要新鮮的標(biāo)本,還無法廣泛展開；后者一般采用口服示蹤分子,檢測經(jīng)腸道重吸收后進(jìn)入循環(huán)的含量。所采用的示蹤分子需要滿足三個(gè)條件:1、無毒或低毒；2、正常情況

3、下不被吸收；3、可以在尿液中定量檢測。目前多采用檢測尿液中小分子糖類的方法,根據(jù)不同糖類分子的吸收特性,可以反映不同腸道節(jié)段的粘膜通透性,常規(guī)采用乳果糖/甘露醇比值代表小腸通透性,采用24小時(shí)三氯蔗糖排泄量代表結(jié)腸通透性。另外常用的示蹤分子是放射性51Cr-EDTA,可以檢測全腸道通透性,但因?yàn)榫哂幸欢ǚ派湫院托枰R時(shí)配置的特點(diǎn),相比糖分子檢測使用范圍較小。
　　 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種新型的消化內(nèi)窺鏡,可以在常規(guī)內(nèi)窺鏡檢查的

4、同時(shí),提供放大500-1000倍的粘膜圖像,達(dá)到與橫切面病理切片近似的灰度圖像。除此之外,由于其光學(xué)特性,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡的顯影需要應(yīng)用熒光素作為對(duì)比劑。在潰瘍性結(jié)腸炎病人中可以觀察到熒光素滲漏入結(jié)腸隱窩腔,而熒光素滲漏與炎癥的病理分級(jí)密切相關(guān)。因此本研究目的在于通過共聚焦激光顯微內(nèi)鏡結(jié)腸粘膜形態(tài)和功能兩方面的特征,獲取更準(zhǔn)確的結(jié)腸粘膜損傷的診斷。
　　 方法：
　　 第一部分:收集2008.06.01-2009.04

5、.01在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院進(jìn)行隨訪的73名潰瘍性結(jié)腸炎病人作為研究對(duì)象。所有病人自愿選擇共聚焦激光顯微內(nèi)鏡代替常規(guī)內(nèi)鏡檢查,并且簽署知情同意書。首先應(yīng)用白光內(nèi)鏡模式下炎癥分級(jí)(Baron分級(jí))評(píng)分將所觀察到的粘膜表現(xiàn)分為四級(jí):0級(jí)正常腸粘膜,1級(jí)介于0級(jí)和2級(jí)之間,2級(jí)碰觸腸粘膜易出血,3級(jí)腸粘膜自發(fā)性出血。其中0級(jí)和1級(jí)代表正常和慢性非活動(dòng)性炎癥；2級(jí)和3級(jí)代表急性活動(dòng)性炎癥。之后用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡的顯微鏡模式將炎癥分為四級(jí):A級(jí)隱窩

6、大小正常,排列規(guī)則；B級(jí),隱窩大小正常,排列紊亂；C級(jí),隱窩排列更趨紊亂,隱窩開口擴(kuò)張,可有熒光素滲出；D級(jí),正常隱窩結(jié)構(gòu)大量破壞,可有隱窩膿腫。其中A級(jí)和B級(jí)代表正常和慢性非活動(dòng)性炎癥；C級(jí)和D級(jí)代表急性活動(dòng)性炎癥。除隱窩結(jié)構(gòu)之外,觀察結(jié)腸隱窩腔內(nèi)熒光素滲漏情況,按照有無熒光素滲漏分為兩組。對(duì)共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下間質(zhì)微血管改變分為三級(jí):無改變,輕到中度改變和重度改變。除主觀分級(jí)外,將獲取的共聚焦激光顯微內(nèi)鏡靜態(tài)圖像做客觀定量分析,以單

7、位圖像面積內(nèi)隱窩數(shù)量作為隱窩結(jié)構(gòu)的客觀指標(biāo),以灰度值作為熒光素滲漏的客觀指標(biāo)。觀察部位進(jìn)行靶向活檢,常規(guī)送病理,由三位病理醫(yī)師獨(dú)立作出炎癥分級(jí)診斷。所用炎癥分級(jí)按照Geboes分級(jí)法,共分為6級(jí),≤3級(jí)作為非活動(dòng)性炎癥,>3代表急性活動(dòng)性炎癥。將白光內(nèi)鏡下和顯微內(nèi)鏡下各炎癥活動(dòng)度指標(biāo)與病理論斷分別作相關(guān)性分析。
　　 第二部分:收集2009.04.01-06.30的潰瘍性結(jié)腸炎患者10人,符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)的腸易激綜合征患者12

8、人,以及健康查體或結(jié)腸息肉電切后隨訪的對(duì)照8人。所有病人空腹口服三聯(lián)糖分子(乳果糖10克,甘露醇5克,三氯蔗糖5克)溶液,后留取24小時(shí)尿液,行氣象色譜分析法檢測腸粘膜通透性。以前5小時(shí)尿液中乳果糖/甘露醇比例作為小腸通透性指標(biāo),24小時(shí)三氯蔗糖排泄量作為結(jié)腸通透性指標(biāo)。之后所有病人接受共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢查,對(duì)病人結(jié)腸每10cm觀察熒光素滲漏表現(xiàn),記錄熒光素滲漏涉及的范圍,熒光素滲漏的程度,出現(xiàn)熒光素滲漏與注射熒光素之間的時(shí)間。將熒光

9、素滲漏情況與腸粘膜通透性檢測結(jié)果行相關(guān)性分析。對(duì)部分患者,于熒光素注射之前在回盲部局部噴灑吖啶黃,記錄單位層面上上皮細(xì)胞空隙數(shù)量,注射熒光素之后重新計(jì)數(shù)上皮細(xì)胞空隙數(shù)量,觀察熒光素注射前后腸粘膜上皮空隙的數(shù)量變化。分別于熒光素滲漏和無滲漏部位行靶向活檢,獲取的組織予透射電鏡觀察,重點(diǎn)觀察基底膜完整性,以及炎癥細(xì)胞穿過基底膜的情況,分析熒光素滲漏與基底膜完整性破壞間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:共聚焦激光顯微內(nèi)

10、鏡相比白光內(nèi)鏡對(duì)炎癥程度的判斷更加精確,尤其對(duì)于白光內(nèi)鏡下表現(xiàn)正?；騼H有輕度炎癥的病變,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對(duì)急性活動(dòng)性炎癥的判斷更加敏感。在50個(gè)病理論斷有急性活動(dòng)性炎癥的患者中,白光內(nèi)鏡判斷有19人為正常或慢性炎癥；而應(yīng)用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡觀察,所有50例急性活動(dòng)性炎癥均被診斷為C級(jí)和D級(jí)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡相比白光內(nèi)鏡對(duì)炎癥活動(dòng)度的判斷更為準(zhǔn)確(P=0.005)。在共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下隱窩形態(tài)改變與病理分級(jí)間存在顯著相關(guān)性(Spea

11、rman rho,P<0.001)。熒光素滲漏更多見于急性活動(dòng)性炎癥中(P<0.001)。血管改變與炎癥活動(dòng)度間亦存在顯著正相關(guān),共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下表現(xiàn)為重度血管病變的患者,病理論斷均顯示為急性活動(dòng)性炎癥?？陀^量化分析顯示:單位共聚焦激光顯微內(nèi)鏡圖像內(nèi)隱窩數(shù)量與隱窩形態(tài)分級(jí)存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001);單位面積內(nèi)隱窩數(shù)量與病理評(píng)分間存在明顯負(fù)相關(guān)(P=0.001),而灰度分析未能支持熒光素滲漏(P=0.194)。
　　 第

12、二部分:熒光素滲漏表現(xiàn)與結(jié)腸粘膜通透性檢測存在顯著相關(guān)性,有熒光素滲漏患者的24小時(shí)三氯蔗糖排泄率顯著高于無熒光素滲漏者(total sucralose secretion:FLIL,60.64±18·07mg vs.non-FLIL,33.26±8.54mg,P=0.013)。熒光素滲漏時(shí)間依賴性不明顯,有熒光素滲漏者出現(xiàn)的時(shí)間可短在注射熒光素鈉后2分鐘內(nèi)出現(xiàn),而無熒光素滲漏者,即使注射熒光素后20分鐘亦無表現(xiàn)。通透性增高的程度與熒光

13、素滲漏的范圍和程度呈正相關(guān)。結(jié)腸上皮細(xì)胞空隙在熒光素注射前后無顯著變化(Wilcoxon test,P=0.9)。熒光素滲漏部位粘膜透射電鏡顯示多見基地膜疏松、斷裂和淋巴細(xì)胞穿過等表現(xiàn)(Contingencycoefficient,value=0.441,P=0.007),同時(shí),基底膜異常與三氯蔗糖排泄率間存在顯著相關(guān)性,有基底膜異常者三氯蔗糖排泄率高于基底膜正常者(57.66±21.24 vs.42.71±16.77,P=0.04)。

14、
　　 結(jié)論：
　　 一、共聚焦激光顯微內(nèi)鏡可以準(zhǔn)確判斷結(jié)腸粘膜炎癥活動(dòng)程度；
　　 二、對(duì)于白光內(nèi)鏡下表現(xiàn)正?；蚍腔顒?dòng)期的潰瘍性結(jié)腸炎患者,部分仍殘留有隱匿的急性活動(dòng)性炎癥,共聚焦激光顯微內(nèi)鏡可以提供更準(zhǔn)確的判斷；
　　 三、隱窩結(jié)構(gòu)改變、熒光素滲漏和血管改變是共聚焦激光顯微內(nèi)鏡判斷炎癥活動(dòng)度的良好指標(biāo)；
　　 四、共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下熒光素滲漏可以作為粘膜通透性增高的標(biāo)志；
　　 五、

15、熒光素滲漏與粘膜通透性相關(guān)；
　　 六、熒光素滲漏的途徑可能為細(xì)胞間途徑,上皮細(xì)胞空隙對(duì)熒光素保持不可通透狀態(tài)；
　　 七、基底膜結(jié)構(gòu)異常是熒光素滲漏的重要途徑。
　　 研究意義：
　　 本研究提出了共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下結(jié)腸粘膜炎癥活動(dòng)度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)檢驗(yàn)可以準(zhǔn)確區(qū)分正常粘膜、慢性非活動(dòng)性炎癥和急性活動(dòng)性炎癥,對(duì)臨床上潰瘍性結(jié)腸炎患者炎癥活動(dòng)度的判斷提供了更敏感的指標(biāo)。首次觀察到共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下結(jié)腸隱