共聚焦顯微內(nèi)鏡實(shí)時(shí)診斷門(mén)螺桿菌感染和指導(dǎo)EMR治療的研究.pdf

1、背景：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染呈世界性分布，大量臨床及流行病學(xué)資料表明，H.pylori感染導(dǎo)致的黏膜炎癥反應(yīng)是引起諸多胃黏膜相關(guān)疾病的基礎(chǔ)，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤和胃癌等疾病密切相關(guān)，已被世界衛(wèi)生組織下屬的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為Ⅰ類(lèi)致癌因子。目前臨床常用的H.pylori診斷方法包括侵入性和非侵入性兩大類(lèi)，各有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。其中組織切片染色的敏感性和特

2、異性均較高，可同時(shí)觀察黏膜病理學(xué)變化，但傳統(tǒng)組織學(xué)屬于有創(chuàng)檢查且需時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)即時(shí)診斷。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(CLE)是一種新型的內(nèi)鏡技術(shù)，在進(jìn)行常規(guī)電子內(nèi)鏡檢查的同時(shí)，可通過(guò)小型化的共聚焦顯微鏡提供近1000倍放大的消化道黏膜圖像，達(dá)到與橫切病理切片相似的成像效果，有助于內(nèi)鏡醫(yī)師在操作過(guò)程中作出即時(shí)的組織學(xué)診斷并指導(dǎo)靶向活檢。目前已有應(yīng)用CLE實(shí)時(shí)診斷H.pylori感染的個(gè)案報(bào)道，但該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的診斷敏感性、特異性等指標(biāo)尚未

3、明確。在胃黏膜疾病的演進(jìn)過(guò)程中，Correa所提出的慢性淺表性胃炎-萎縮性胃炎-胃黏膜腸上皮化生-上皮內(nèi)瘤變-腸型胃癌的多階段模型已被廣泛認(rèn)可。鑒于H.pylori為重要的致癌因素，長(zhǎng)期以來(lái)H.pylori根除治療對(duì)胃癌發(fā)生的預(yù)防作用也得到了廣泛的關(guān)注。目前已證實(shí)根除H.pylori可緩解胃黏膜炎癥，但對(duì)萎縮和腸上皮化生的影響仍存在很大爭(zhēng)議，在萎縮腸化發(fā)展過(guò)程中可能存在“不可逆轉(zhuǎn)點(diǎn)”，若超過(guò)該點(diǎn)則難以逆轉(zhuǎn)，由于腸上皮化生在胃內(nèi)常呈灶狀分

4、布，普通內(nèi)鏡下隨機(jī)活檢的取樣誤差是影響結(jié)果的重要因素。除H.pylori感染外，黏膜致癌過(guò)程還包括宿主和外界環(huán)境因素的參與。正常的胃黏膜上皮屏障可有效防御和抵抗各種有害理化因素的損傷，黏膜屏障的損傷已被發(fā)現(xiàn)與食管反流病、腸易激綜合征、炎癥性腸病、結(jié)腸瘤變、胃癌等多種疾病相關(guān)。作為常見(jiàn)的癌前狀態(tài)，由于局灶分布取材困難，腸化生黏膜中的上皮屏障功能尚未見(jiàn)研究。借助于CLE可在鏡下準(zhǔn)確區(qū)分正常胃黏膜和腸化黏膜，同時(shí)CLE對(duì)比劑熒光素鈉也是廣泛應(yīng)

5、于上皮細(xì)胞通透性研究的小分子標(biāo)記物，可反映胃上皮屏障的完整性，從而使CLE可全面觀察不同黏膜狀態(tài)在H.pylori根除前后的形態(tài)和功能學(xué)改變。伴腸上皮化生的胃黏膜經(jīng)長(zhǎng)期演變，部分可發(fā)展為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及早期胃癌。對(duì)于此類(lèi)病變，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(EMR)是目前對(duì)早期胃黏膜瘤變內(nèi)鏡治療的主要方法，已在臨床廣泛應(yīng)用并積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。殘余病灶的復(fù)發(fā)是EMR治療后的主要問(wèn)題，病灶的水平和垂直安全邊界均必須

6、充分考慮，但在分塊切除或病灶邊緣燒灼嚴(yán)重的情況下，對(duì)EMR標(biāo)本的水平安全邊界常難以判斷，只能依靠術(shù)后內(nèi)鏡隨訪對(duì)切除邊緣的多次活檢。若可將CLE的實(shí)時(shí)病理優(yōu)勢(shì)發(fā)揮在對(duì)EMR病灶切緣的在體判斷中，則可望提高內(nèi)鏡完全切除的成功率，改善患者預(yù)后。
　　 目的：⑴總結(jié)吖啶黃染色下胃黏膜H.pylori感染的直接和間接征象，前瞻性研究共聚焦顯微內(nèi)鏡對(duì)H.pylori感染的實(shí)時(shí)診斷效率。⑵胃黏膜在H.pylori感染及腸上皮化生等情況下，是否

7、存在胃上皮屏障功能的損傷；應(yīng)用H.pylori根除治療對(duì)胃內(nèi)腸化黏膜和非腸化黏膜的影響差別。⑶前瞻性評(píng)估共聚焦顯微內(nèi)鏡在輔助判斷EMR切除完全性中的價(jià)值。
　　 方法①共聚焦顯微內(nèi)鏡對(duì)H.pylori感染的實(shí)時(shí)診斷。應(yīng)用整合式共聚焦顯微內(nèi)鏡(Pentax EC3870K)，以黏膜表面噴灑吖啶黃作為對(duì)比劑，對(duì)2008年8月至2009年3月間計(jì)劃行胃鏡檢查且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)患者進(jìn)行CLE檢查。研究過(guò)程分為兩個(gè)階段，第一階段選取前2

8、0位患者的共聚焦圖像及相應(yīng)橫切病理圖像，由3位內(nèi)鏡專(zhuān)家和1位資深病理專(zhuān)家進(jìn)行開(kāi)放式評(píng)估，總結(jié)CLE下H.pylori感染的特征，建立H.pylori感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。第二階段對(duì)83位連續(xù)患者進(jìn)行前瞻性CLE檢查，分別觀察其胃竇、胃體的大彎及小彎側(cè)黏膜，根據(jù)制定的CLE診斷標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)判斷是否存在H.pylori感染征象。將活檢組織改良Giemsa染色和快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)與CLE結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，評(píng)估其診斷效率。同時(shí)隨機(jī)選取50位患者圖片

9、，由3名未參加實(shí)時(shí)判斷的CLE內(nèi)鏡醫(yī)師進(jìn)行觀察者間一致性檢驗(yàn)。②共聚焦顯微內(nèi)鏡下H.pylori與胃腸上皮化生對(duì)黏膜屏障功能的影響。選擇2009年1月至2009年11月間來(lái)院就診的已知胃黏膜腸上皮化生患者，同意行CLE檢查代替普通內(nèi)鏡者納入研究。先行普通白光模式觀察，之后靜脈給予5ml10％熒光素鈉作為對(duì)比劑，開(kāi)啟共聚焦顯微模式進(jìn)一步觀察。操作者在CLE引導(dǎo)下選擇性區(qū)分患者胃內(nèi)的腸化及非腸化黏膜，各取靶向活檢2塊，1塊用于觀察黏膜的病理

10、組織學(xué)改變，另1塊用于硝酸鑭示蹤電鏡觀察上皮屏障緊密連接改變，記錄電鏡下每50個(gè)緊密連接中出現(xiàn)硝酸鑭陽(yáng)性標(biāo)記的比例。同時(shí)利用熒光素鈉作為上皮細(xì)胞間通透性標(biāo)記物的特點(diǎn)，在CLE下分別對(duì)腸化及非腸化黏膜的上皮細(xì)胞間隙進(jìn)行觀察，以細(xì)胞間隙出現(xiàn)白亮的熒光素滲出為緊密連接受損，根據(jù)視野內(nèi)熒光素滲出范圍評(píng)為0-4分，將CLE鏡下對(duì)緊密連接的評(píng)分與硝酸鑭示蹤電鏡評(píng)分進(jìn)行對(duì)照初次CLE觀察結(jié)束后，腸化患者中H.pylori陽(yáng)性者接受2周的三聯(lián)根除治療，

11、6個(gè)月后對(duì)患者進(jìn)行隨訪，同前步驟進(jìn)行CLE和示蹤電鏡觀察，對(duì)比不同黏膜狀態(tài)對(duì)H.pylori根除治療的反應(yīng)效果。③共聚焦顯微內(nèi)鏡對(duì)EMR切除完全性的輔助判斷。納入2009年1月至2010年3月在我院因胃上皮內(nèi)瘤變和早期胃癌擬行EMR治療的患者，患者術(shù)前均經(jīng)超聲內(nèi)鏡檢查評(píng)估病灶的垂直深浸潤(rùn)度，確認(rèn)病灶位于黏膜層。EMR操作經(jīng)普通內(nèi)鏡應(yīng)用透明帽輔助法或注射一圈套器切除法進(jìn)行。以EMR標(biāo)本邊界無(wú)殘余瘤變且術(shù)后內(nèi)鏡隨訪陰性認(rèn)為完全切除，若邊界存

12、在瘤變定為切除失敗，垂直邊界殘余者轉(zhuǎn)外科手術(shù)治療。EMR術(shù)后2周通過(guò)共聚焦顯微內(nèi)鏡觀察切緣，操作者根據(jù)CLE下瘤變標(biāo)準(zhǔn)對(duì)切緣是否存在殘余病灶行進(jìn)實(shí)時(shí)判斷，若無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)則對(duì)切緣行常規(guī)隨機(jī)活檢，若懷疑殘留病灶存在，則在揭盲后進(jìn)行追加EMR治療。將首次切除、追加切除和隨訪活檢的結(jié)果作為最終診斷與CLE診斷進(jìn)行對(duì)照。
　　 結(jié)果：⑴第一階段結(jié)果顯示H.pylori感染患者的胃上皮共聚焦圖像與橫切病理具有良好的一致性，以共聚焦圖像中出現(xiàn)以

13、下三個(gè)特征之一診斷為H.pylori感染：1.直接征象：胃小凹及表面上皮查見(jiàn)白色點(diǎn)狀菌體；2.間接征象：胃黏膜表面見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞在吖啶黃染色后可出現(xiàn)特異性細(xì)胞核結(jié)構(gòu)；3.間接征象：胃小凹和上皮內(nèi)的微小膿腫形成。在第二階段的前瞻性研究中，共獲得6823幅CLE圖像，平均82幅/每人，共37名(44.6％)患者被最終診斷為H.pylori感染。CLE在體診斷H.pylori感染的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)

14、值分別為92.8％，89.2％，95.7％，94.3％，和91.7％。CLE圖像的觀察者間差異kappa值為0.78，在各診斷征象中，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)兼有良好的敏感性和特異性(83.8％和97.8％)。CLE下的H.pylori感染改變?cè)谖父]部較胃體部更為明顯(94.3％vs45.7％，P<0.001)。⑵共計(jì)42名胃腸上皮化生患者納入研究，其中H.pylori陽(yáng)性患者20例。在透射電鏡示蹤下，胃黏膜上皮緊密連接破壞時(shí)在上皮間隙可見(jiàn)硝酸鑭

15、標(biāo)記，H.pylori陽(yáng)性患者中腸化和非腸化標(biāo)本的電鏡通透性評(píng)分值分別為54±31％和72±28％，且pylori陰性患者腸化標(biāo)本的通透性評(píng)分值為67±34％，三者均顯著大于H.pylori陰性非腸化標(biāo)本(3±6％，均p<0.05)。CLE下上皮細(xì)胞間熒光素滲出評(píng)分與電鏡示蹤結(jié)果一致，H.pylori陽(yáng)性患者中腸化和非腸化上皮CLE通透性評(píng)分值分別為2.60±1.03和2.83±0.81，H.pylori陰性患者腸化上皮通透性評(píng)分值為2

16、.82±1.00，三者同樣均高于H.pylori陰性非腸化上皮(0.21±0.24，均p<0.05)。CLE下出現(xiàn)上皮細(xì)胞間熒光素滲出的黏膜分布與示蹤電鏡具有高度一致性(R值=0.834，p<0.0001)。6個(gè)月后20名接受根除治療的患者中18名返回隨訪，其中14例H.pylori根除成功。經(jīng)CLE與示蹤電鏡結(jié)果顯示，根除后非腸化黏膜的通透性評(píng)分較根除前得到顯著改善(均p<0.001)，但腸化區(qū)黏膜通透性評(píng)分未見(jiàn)明顯改善(p>0.05

17、)。⑶經(jīng)超聲內(nèi)鏡檢查后，共對(duì)27名患者的27處早期胃瘤變病灶進(jìn)行了EMR治療，其中19例為整體切除，8例為分塊切除。對(duì)切除標(biāo)本行病理檢查后，3例因垂直邊緣檢出瘤變定為切除失敗行手術(shù)治療。剩余的24名患者兩周后接受CLE檢查，其中有9名患者因分塊切除和邊界判斷困難進(jìn)行了至少2次CLE隨訪。隨訪過(guò)程中7名患者在CLE下被懷疑存在腺體結(jié)構(gòu)異常。最終病理結(jié)果證實(shí)其中的5名患者切緣存在上皮內(nèi)瘤變(2例高級(jí)別瘤變和3例低級(jí)別瘤變)。CLE對(duì)EMR切

18、除完全性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性分別為91.7％，100.0％和89.5％。經(jīng)CLE觀察后6名患者接受了CLE引導(dǎo)下的追加EMR治療，經(jīng)平均8.3個(gè)月的隨訪后未再發(fā)現(xiàn)殘余灶和復(fù)發(fā)。
　　 結(jié)論：①共聚焦顯微內(nèi)鏡可對(duì)H.pylori感染胃黏膜表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰成像，CLE對(duì)H.pylori感染的實(shí)時(shí)診斷快速簡(jiǎn)便，具有較高的準(zhǔn)確性。②H.pylori感染及腸上皮化生均可導(dǎo)致胃上皮屏障中緊密連接破壞增加，通透性升高。H.pylor