共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細胞歸巢示蹤及結(jié)腸粘膜菌群與生理狀態(tài)相關性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體干細胞歸巢示蹤研究
　　目的:
　　間充質(zhì)干細胞是一種具有多能干細胞，具有體內(nèi)組織修復和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞具有治療炎癥性腸病的重要潛在應用價值。間充質(zhì)干細胞的移植后在受者體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸受到干細胞來源、移植方式、受者免疫狀體、移植次數(shù)等多方面因素的影響，具有顯著的個體差異。然而目前尚沒有一種可行的方法個體化地評估輸注到體內(nèi)的間充質(zhì)干

2、細胞向腸粘膜歸巢效率。傳統(tǒng)的影像學示蹤方法難以有效地區(qū)分死細胞殘片和存活的間充質(zhì)干細胞，同時也難以評估干細胞向腸粘膜的歸巢效率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡是近年來發(fā)明的一種新型內(nèi)鏡，能夠在體內(nèi)無創(chuàng)、實時地顯示組織形態(tài)，放大倍率可達1000倍，并具有細胞水平的分辨率。共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡所采用的激發(fā)波長為488 nm，接波長為505～585 nm，同增強型綠色熒光蛋白的光學特性相匹配。本研究中我們提出使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡有可能在活體內(nèi)以細胞水

3、平的分辨率無創(chuàng)地示蹤間充質(zhì)干細胞向腸粘膜歸巢。
　　方法:
　　從Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)分離、鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，分別使用增強型綠色熒光蛋白和活體染料羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)標記骨髓間充質(zhì)干細胞，使用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體外對標記的間充質(zhì)干細胞成像。進一步將增強型綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質(zhì)干細胞(eGFP-MSC)通過靜脈注射或者腹腔注射途徑輸注到DSS誘導的結(jié)腸炎大鼠模型體內(nèi)，并使用共聚焦激光顯

4、微內(nèi)鏡進行活體成像。所獲得的圖像同對組織切片進行免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交得到的圖像進行對比。明確向結(jié)腸粘膜歸巢的eGFP-MSC在共聚焦激光顯微內(nèi)鏡下的形態(tài)特征。進一步比較不同條件下eGFP-MSC向大鼠結(jié)腸炎癥粘膜的歸巢效率，分別以四種不同條件構(gòu)建移植模型1）大鼠-大鼠干細胞同種異體移植，2）人-大鼠干細胞異種移植，3）低氧處理大鼠間充質(zhì)干細胞后同種異體移植，4）受體大鼠經(jīng)白消安免疫抑制處理后移植同種異體干細胞。四種條件下

5、移植后均同法進行共聚焦激光顯微內(nèi)鏡成像，示蹤間充質(zhì)干細胞。編寫自動化圖像識別程序，自動識別圖像干細胞并計算頻率。
　　結(jié)果:
　　通過密度梯度離心法從供體大鼠骨髓中成功分離了骨髓間充質(zhì)干細胞，所得細胞在適當?shù)臈l件下能成功分化為骨組織、脂肪組織和軟骨組織。間充質(zhì)干細胞流式細胞鑒定表達CD29(+)，CD44(+)，CD73(+)和CD90(+)，不表達CD34（-），CD45（-）和CD11b/c（-）。上述表型符合大鼠間充質(zhì)

6、干細胞定義。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠在體外清晰地看到增強型綠色熒光蛋白或活體染料CFSE標記骨髓間充質(zhì)干細胞，體外成像同熒光顯微鏡觀察特征接近。使用FIVE1共聚焦內(nèi)鏡系統(tǒng)能夠在大鼠活體腸粘膜上無創(chuàng)性地觀察到eGFP-MSC，其特征為明亮的、圓形并帶有內(nèi)部異質(zhì)性的細胞核。免疫熒光、免疫組化和熒光免疫原位雜交均證實受體大鼠腸粘膜上存在eGFP陽性的細胞。在大鼠-大鼠同種異體移植、人-大鼠異種移植、低氧誘導間充質(zhì)干細胞和白消安免疫抑制受體大鼠

7、四種不同條件干細胞移植模型中，活體共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠顯示移植后向受體大鼠腸粘膜歸巢的間充質(zhì)干細胞數(shù)量，并通過自動圖像處理程序計數(shù)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡定量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低氧誘導后，eGFP-MSC向炎癥腸粘膜的效率有增加趨勢(低氧誘導組114.1 vs其他組合并34.3，t=2.14，P=0.0644)。
　　結(jié)論:
　　共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種能夠在活體內(nèi)示蹤間充質(zhì)干細胞移植后向腸粘膜歸巢的新型工具，具有良好的應用前景。這種臨

8、床可用的無創(chuàng)性的細胞水平示蹤技術(shù)能夠為患者個體化的干細胞治療提供依據(jù)。
　　意義:
　　本研究是世界上首次使用內(nèi)鏡設備對干細胞進行體內(nèi)示蹤，而且具有細胞水平分辨率。對比先前的影像學示蹤方法，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡不會受到死細胞碎片的影響，只有活的完整細胞能夠顯像，在消化道粘膜對干細胞示蹤具有明顯的優(yōu)越性。
　　第二部分 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體評估結(jié)腸粘膜生理功能與粘膜菌群相關性研究
　　目的:
　　人類腸道中寄

9、居著數(shù)量龐大的微生物群體。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人類腸道菌群的組成逐漸被人們認識。人類腸道菌群在人類健康的維持中起了至關重要的作用，但在結(jié)直腸粘膜上，腸道菌群如何同宿主相互作用仍不清楚。有研究報道，結(jié)直腸菌群受到宿主腸道生理狀態(tài)的影響，例如腸道氧氣分壓顯著影響腸道菌群能量代謝。腸道菌群很可能同時受到多種宿主生理狀態(tài)的影響，然而先前研究中從未將腸道的多項生理功能同粘膜菌群同時進行分析研究。這可能是受限于臨床可行性，同時檢測多項

10、指標需要從同一受試者身上取得相應數(shù)量的標本，對受試者造成創(chuàng)傷。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是近年來進入臨床應用的一種新型內(nèi)鏡設備，可以在受試者消化道內(nèi)進行無創(chuàng)性的成像，在提供實時組織圖像的同時，反應結(jié)直腸粘膜的多項生理功能。本課題中，我們創(chuàng)新性地提出了共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠通過顯示宿主腸粘膜的在體生理狀態(tài)來分析宿主與腸道菌群的相互作用關系。這有助于闡明宿主-腸道菌群相互作用規(guī)律。
　　方法:
　　自2013年11月至2014年4月，在

11、山東大學齊魯醫(yī)院召集受試者參與此項研究。符合納入條件的受試者常規(guī)進行共聚焦激光顯微結(jié)腸鏡檢查。檢查過程中先進行白光內(nèi)鏡篩查，對病變部位和臨近的正常對照部位使用探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡檢查。利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡評估受試者結(jié)直腸粘膜上皮的生理狀態(tài)，對結(jié)腸粘膜形態(tài)和生理功能的9個特征進行評估，分別為杯狀細胞密度、隱窩擴大、星狀隱窩、長管狀隱窩、上皮滲漏熒光素、上皮變厚、隱窩內(nèi)有熒光素、熒光素漏出血管、浸潤的細胞群。對所檢查部位的粘膜活檢，通

12、過16s rDNA焦磷酸測序的方法檢測腸粘膜菌群組成。對測序數(shù)據(jù)進行初步處理得出每個樣本中各物種的含量，通過微生物多樣性分析、聚類分析、主坐標分析與非冗余分析和LEfSe分析闡明腸道菌群組成及其同活檢部位、疾病狀態(tài)的關系，利用網(wǎng)絡分析分析結(jié)直腸粘膜菌群同結(jié)直腸粘膜形態(tài)和生理狀態(tài)間的相關關系。利用PICRUSt算法預測菌群的宏基因組，同法利用網(wǎng)絡分析分析腸粘膜生理狀態(tài)同菌群的宏基因組功能通路間的相關性。
　　結(jié)果:
　　本研究

13、共篩查267名受試者，其中的39名患者進入最終數(shù)據(jù)分析。所獲得的樣本共有結(jié)腸腺瘤病變25處，潰瘍性結(jié)腸炎病變5處，內(nèi)鏡下正常病變39處。粘膜菌群高通量測序的結(jié)果經(jīng)過降噪、去除低質(zhì)量序列和嵌合體等預處理步驟，共獲得554，070條優(yōu)質(zhì)序列。不同病變類型間腸粘膜菌群生物多樣性無明顯不同。腺瘤組的組內(nèi)距離和不同組的組間距離顯著高于正常粘膜的組內(nèi)距離（兩者均p＜0.05）。人類腸粘膜菌群聚集為三個主要的聚類，分別由普氏菌、擬桿菌和乳酸球菌主導。

14、粘膜菌群的聚類同活檢部位和疾病狀態(tài)間并無顯著的相關性，但菌群與其棲息的粘膜生理狀態(tài)間存在密切的關系，后者可以通過共聚焦激光顯微內(nèi)鏡無創(chuàng)性地在體觀察。網(wǎng)絡分析顯示結(jié)直腸粘膜菌群可以分為兩個亞網(wǎng)絡與相對孤立的梭桿菌，亞網(wǎng)絡內(nèi)部成員細菌間只存在正相關關系，不同亞網(wǎng)絡的成員細菌之間只存在負相關關系。粘膜炎癥改變粘膜菌群中兩個亞網(wǎng)絡的平衡關系。梭桿菌同粘膜生理功能之間存在最密切的關系，而同其他粘膜細菌間沒有相關性。炎癥細胞浸潤同粘膜宏基因組中多個

15、組分存在相關關系，其中包括Ⅳ型分泌系統(tǒng)的VirD2成分。
　　結(jié)論:
　　本課題發(fā)現(xiàn)腸粘膜菌群同腸粘膜生理狀態(tài)之間存在密切的相關關系。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一種臨床可用的檢查工具，可以在體內(nèi)用來研究腸粘膜生理狀態(tài)同腸粘膜菌群之間的關聯(lián)網(wǎng)絡。
　　意義:
　　本研究是世界上首次將內(nèi)鏡設備應用于腸道菌群研究，為宿主-菌群關系研究提供了一種全新的、臨床可行的研究方法。本研究所發(fā)現(xiàn)的粘膜菌群宏基因組同粘膜生理功能之間的相關