納米金標(biāo)芯片優(yōu)化及在前列腺癌臨床診斷上的應(yīng)用研究.pdf

1、近年來(lái)，我國(guó)男性前列腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，在歐美國(guó)家，前列腺癌己連續(xù)多年居男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，其發(fā)病率超過(guò)肺癌，死亡率在男性惡性腫瘤中居第二位。前列腺癌是一個(gè)起源于多病灶和隨機(jī)進(jìn)展模式的異質(zhì)性疾病。到目前為止對(duì)晚期和轉(zhuǎn)移性尤其是激素非依賴(lài)型、放療和化療抵抗型前列腺癌依然沒(méi)有治愈的療法。研究前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的基因可能揭示其機(jī)制或找出新的治療靶標(biāo)。
　　 基因芯片技術(shù)具有高通量、高特異性等特點(diǎn)，在疾病診斷等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛，

2、但是目前主要基因芯片技術(shù)均存在著檢測(cè)儀器昂貴或靈敏度較低等問(wèn)題，從而限制該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。
　　 本研究利用納米金可以與銀結(jié)合后形成體積為原來(lái)106倍的黑色顆粒，并且可以憑肉眼觀察，普通掃描儀讀取圖像的特點(diǎn)，將納米金應(yīng)用于基因芯片檢測(cè)技術(shù)。首先建立定性檢測(cè)的納米金標(biāo)記芯片技術(shù)，并對(duì)芯片技術(shù)中點(diǎn)樣液，預(yù)雜交，納米金濃度，銀染時(shí)間等多個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，使用50％DMSO作為點(diǎn)樣液效果最好，預(yù)雜交會(huì)導(dǎo)致雜交信號(hào)降低70％，

3、銀染時(shí)間控制在15 min時(shí)顯色清晰且背景較低。該檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)到80 fmol/L，為建立穩(wěn)定性，重復(fù)性好的納米金標(biāo)芯片技術(shù)打下基礎(chǔ)。
　　 同時(shí)摸索將納米金標(biāo)芯片技術(shù)用于前列腺癌臨床診斷，PCa是多因素、多基因突變引起的疾病，憑單一指標(biāo)的檢測(cè)無(wú)法準(zhǔn)確判斷，故經(jīng)充分的文獻(xiàn)調(diào)研，預(yù)選了11個(gè)前列腺癌特異性靶標(biāo)(IGF1、P27、AR、PSMA、KLK3/PSA、PCNA、Ki-67、KLK1、KLK2、TMPRSS2、SR

4、EBF2)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各基因表達(dá)進(jìn)行研究。本研究首次將納米金標(biāo)芯片用于基因表達(dá)研究，為更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，首先使用目前已?jīng)成熟并且成本較低的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記法摸索建立了探針設(shè)計(jì)，芯片制備，樣本標(biāo)記，至雜交反應(yīng)的前期實(shí)驗(yàn)條件。研究發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)寡核苷酸探針濃度達(dá)到100μM時(shí)，各檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)最強(qiáng)。
　　 (2)進(jìn)行樣本標(biāo)記過(guò)程中，采用biotin-16-dUTP為40μM，而dTTP為40μM的反轉(zhuǎn)錄體系。
　

5、　 (3)使用辣根過(guò)氧化物酶芯片標(biāo)記法對(duì)PC3和DU145兩種細(xì)胞株的11個(gè)前列腺癌特異靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)本中各基因表達(dá)差異不明顯，這為使用納米金標(biāo)芯片檢測(cè)提供了一個(gè)依據(jù)。
　　 在前期研究基礎(chǔ)之上，雜交后改用納米金進(jìn)行標(biāo)記，并對(duì)納米金濃度進(jìn)行了優(yōu)化，在稀釋梯度為1∶100(此時(shí)納米金濃度為0.250D/ml)時(shí)，研究結(jié)果為各探針點(diǎn)呈現(xiàn)明顯的顯色點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)顯色，符合實(shí)驗(yàn)要求，但是在定量方面暫時(shí)還不滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。