放射性碘標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素—葡聚糖的制備及生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、研究背景及目的 天然生長(zhǎng)抑素是14肽或28肽，廣泛分布于人體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和其它多種組織，對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)抑素受體的五種亞型都具有高的親和力[1]。但由于其在體內(nèi)的生物半衰期只有3分鐘，因此不適宜臨床應(yīng)用。在過去的20余年中，研究者們?nèi)斯ず铣闪舜罅堪胨テ谙鄬?duì)較長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑素類似物，如奧曲肽、蘭若肽等，用放射性核素標(biāo)記后應(yīng)用于臨床進(jìn)行生長(zhǎng)抑素受體陽(yáng)性腫瘤的診斷和治療。但在研究及應(yīng)用過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)此類人工合成的生長(zhǎng)抑素類似物僅對(duì)生長(zhǎng)抑

2、素受體亞型2和5具有高親和力，對(duì)其它亞型無(wú)親和力，從而使其在臨床上的應(yīng)用受到極大的限制。近年來(lái)，有學(xué)者將天然生長(zhǎng)抑素與葡聚糖偶聯(lián)，合成了對(duì)生長(zhǎng)抑素受體五種亞型均保持高親和力的糖基化生長(zhǎng)抑素[2,3]，通過采用不同分子量的葡聚糖調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑素的生物半衰期及體內(nèi)分布[4,5]。這項(xiàng)研究受到了越來(lái)越多的關(guān)注，但是糖基化生長(zhǎng)抑素與目前研究使用較廣泛的生長(zhǎng)抑素類似物-奧曲肽的競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合能力及體內(nèi)生物學(xué)分布方面的對(duì)比研究尚不夠深入。本課題采用分子量

3、為10kD的葡聚糖和酪膠合成適于放射性碘標(biāo)記的糖基化生長(zhǎng)抑素(Tyramine-Dx10-SMS)，利用其與Tyr3-Octreotide競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合的方法，測(cè)定其對(duì)生長(zhǎng)抑素受體的親和力，并對(duì)所制備的125Ⅰ標(biāo)記的糖基化生長(zhǎng)抑素進(jìn)行了正常SD大鼠體內(nèi)分布、血液清除實(shí)驗(yàn)。本課題旨在深入闡明Tyramine-Dx10-SMS的生物學(xué)特性及體內(nèi)分布狀況，從而尋求一種比奧曲肽更好的，能夠與生長(zhǎng)抑素受體所有5種亞型都高親和力結(jié)合的廣譜型放射性標(biāo)記

4、物，為適用于所有生長(zhǎng)抑素受體亞型陽(yáng)性腫瘤顯像診斷和治療的廣譜型放射性標(biāo)記物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，因此具有重要理論和實(shí)際意義。 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)用高碘酸鈉將葡聚糖氧化，向活化的葡聚糖溶液中加入生長(zhǎng)抑素和氰基硼氫化鈉反應(yīng)后，再向反應(yīng)瓶中加入酪胺(Tyramine)繼續(xù)反應(yīng)，然后反應(yīng)液經(jīng)PD-10柱分離純化，收集糖基化生長(zhǎng)抑素產(chǎn)物(酪胺-葡聚糖-生長(zhǎng)抑素，Tyramine-Dx10-SMS)。于分光光度儀測(cè)定糖基化

5、生長(zhǎng)抑素樣品的吸光度，從而確定樣品中生長(zhǎng)抑素含量。 采用Iodogen法碘化標(biāo)記糖基化生長(zhǎng)抑素：將Iodogen涂于瓶底，分別加入磷酸緩沖液，Tyramine-Dx10-SMS溶液和Na125Ⅰ溶液，室溫下反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)PD-10分離純化，除去游離Na125Ⅰ，收集標(biāo)記樣品。室溫條件下，將純化的標(biāo)記樣品點(diǎn)樣于快速薄層色層紙(ITLC-SG)，用放射性薄層掃描儀測(cè)量其放射性分布，并計(jì)算125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS的

6、放化純度。 自行制備SD大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞膜，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白濃度。利用競(jìng)爭(zhēng)取代結(jié)合實(shí)驗(yàn)在體外測(cè)定Tyramine-Dx10-SMS的受體結(jié)合特性。按照課題設(shè)計(jì)，向試管中加入已稀釋好的各種試劑：膜蛋白；放射配基125Ⅰ-Tyr3-Octreotide；濃度遞增的競(jìng)爭(zhēng)劑Tyramine-Dx10-SMS樣品和Tyr3-Octreotide以及非特異組抑制劑Tyr3-Octreotide和反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)管在水浴中保溫，快速通

7、過濾膜終止結(jié)合反應(yīng)，于γ計(jì)數(shù)儀上測(cè)量其放射性。特異性結(jié)合等于總結(jié)合減去非特異性結(jié)合，每個(gè)劑量點(diǎn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPadPrism4.0軟件進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析，計(jì)算IC50值。另外以125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS與大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞膜SSR2行多點(diǎn)飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)。 取正常SD大鼠隨機(jī)分組，每組3只。經(jīng)尾靜脈注射125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS，于注射后不同時(shí)間點(diǎn)斷頸處死大鼠，取血及主要臟器，稱重并測(cè)

8、量其放射性，經(jīng)衰變校正后計(jì)算每個(gè)臟器攝取的放射性占總注射劑量的百分?jǐn)?shù)(％ID/g)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.HPLC分析結(jié)果顯示，合成的125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS無(wú)聚合體，化學(xué)純度＞99％。 2.125Ⅰ-Tyramine-Dx10-SMS的標(biāo)記效率＞60％，放化純＞98％，體外穩(wěn)定，4℃下放置72小時(shí)放化純無(wú)改變。 3.在受體競(jìng)爭(zhēng)取代結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，糖基化的生長(zhǎng)抑素保持對(duì)生長(zhǎng)抑素2型受體高的親和力

9、；其IC50值8.45nM與Tyr3-Octreotide(1.49nM)相近(同在低nM水平)。在飽和實(shí)驗(yàn)中室溫14小時(shí)、37℃5小時(shí)未達(dá)到飽和坪區(qū)，SB/TB：最高61％，TB/Tcpm：最高1.42％。 4.125Ⅰ標(biāo)記的糖基化生長(zhǎng)抑素經(jīng)尾靜脈注射血液半衰期為6.7h，主要濃聚于肝、脾等并經(jīng)腎排泄，腎上腺具有較高的放射性攝吸，24h內(nèi)無(wú)明顯變化。 結(jié)論 生長(zhǎng)抑素的糖基化(125Ⅰ-Tyramine-Dx10