衰變加速因子在小鼠異體移植免疫中的作用.pdf

1、衰變加速因子(dcay accelerating factor，DAF，CD55)是一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(CRP)，主要功能是抑制細(xì)胞表面的C3轉(zhuǎn)化酶形成并加速其衰變，C3轉(zhuǎn)化酶是補(bǔ)體激活鏈中的中心放大酶，DAF通過限制C3轉(zhuǎn)化酶保護(hù)細(xì)胞免于自身補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷。
　　在移植免疫的研究中，DAF缺乏可加重缺血再灌注損傷，影響抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(AMR)，它在異種移植器官的表達(dá)可延長(zhǎng)移植器官的生存期，在移植腎組織中DAF表達(dá)與腎功能及移植

2、腎的生存期呈正相關(guān)。
　　我們應(yīng)用小鼠腹腔異位心臟移植模型，以Daf1基因敲除小鼠(Daf1-/-)研究DAF缺乏對(duì)同種異體移植排斥反應(yīng)的作用，并探討其對(duì)T細(xì)胞免疫影響。主要方法、結(jié)果如下:
　　1.成功地建立小鼠腹腔異位心臟移植模型。分別吻合供心主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈、供心肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈。同基因移植心臟平均存活60d以上;同種異基因移植心臟平均存活時(shí)間9d，移植心臟組織病理切片HE染色顯示，彌漫性單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)于血管周

3、圍，急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)。
　　2.供體缺乏DAF加速移植物排斥，增強(qiáng)直接途徑識(shí)別的、抗供體特異性T細(xì)胞免疫。雄性BALB/c(H-2d)小鼠作為受體，移植供體為Daf1-/-(n=7)或WT(n=6)或C3-/-(n=6)的雄性、C57BL/6(B6，H-2b)小鼠的心臟，觀察移植心臟的存活時(shí)間，結(jié)果顯示，供體為C3-/。的移植心臟存活時(shí)間最長(zhǎng)（平均14d），WT次之（平均9.5d），而供體為DAF缺乏的移植心臟存活時(shí)間最短（平均

4、7d）結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以C3H(H-2k)雄性小鼠為受體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，的結(jié)果相似，Daf1-/-供體心臟平均生存8d，WT平均17d，C3-/-平均25d，其中2只超過60d。差異有顯著性(P＜0.01)。在移植心臟排斥當(dāng)天，收集受體小鼠脾臟細(xì)胞，應(yīng)用ELISPOT檢測(cè)受體脾臟細(xì)胞中抗供體抗原的、產(chǎn)生INF-γ的T細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果顯示，接受Daf1-/-心臟的受體小鼠的脾臟細(xì)胞中含有2倍以上的抗供體抗原的、分泌INF-γ

5、的T細(xì)胞（與接受WT心臟的受體比較，p＜0.05），相反，接受心臟的受體小鼠的脾臟細(xì)胞中產(chǎn)生抗供體抗原的、分泌INF-γ的T細(xì)胞頻數(shù)較低，產(chǎn)生INF-γ的T細(xì)胞頻數(shù)分別為:Daf1-/-235.5±60.3、WT98.5±15.3、C3-/-56.3±16.7(/5×104, x±S)。
　　移植術(shù)后第6d（移植物尚未排斥），ELISPOT檢測(cè)受體脾T細(xì)胞反應(yīng)顯示，接受Daf1-/-心臟的受體小鼠的脾臟中抗供體抗原的、分泌INF-

6、γ的T細(xì)胞明顯高于接受WT心臟的受體，結(jié)果為:Daf1-/-269.5±48.2、WT126.0±19.3(/5×104,x±S)(p＜0.01)。
　　3.受體缺乏DAF對(duì)心臟移植生存時(shí)間、抗供體特異性T細(xì)胞免疫無明顯影響。雄性BALB/c(H-2d)小鼠為供體，受體分別為Daf1-/-(n=4)或WT(n=5)雌性B6(H-2b)小鼠，受體為DAF缺乏的移植心臟存活時(shí)間平均10.5d，WT組平均10d，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0

7、.05)。 ELISPOT檢測(cè)受體抗-供體抗原T細(xì)胞數(shù)分別為Daf1-/-266.8±16.9、WT206.0±13.5(/5×104，x±S），兩組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　4.DAF對(duì)移植排斥反應(yīng)的調(diào)節(jié)不依賴于抗供體特異性抗體啟動(dòng)的補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活。雄性BALB/c(H-2d)小鼠作為受體，移植供體為Daf1-/-(n=3)或WT(n=3)雄性B6(H-2b)小鼠的心臟，移植后第6d，以供體（B6小鼠）胸腺細(xì)胞為抗原

8、，流式細(xì)胞法檢測(cè)受體血清中抗-供體抗體。結(jié)果顯示，受體血清中抗供體特異性抗體兩組間差異無顯著性(p＞0.05)。重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠，其體內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞均缺失。將WT(n=3)或Daf1-/-(n=3) B6（H-2b）小鼠的心臟移植到異源的SCID/C3H(H-2k)小鼠體內(nèi)，10d后，經(jīng)小鼠尾靜脈給受體注入來自同源的C3H小鼠脾臟的、未激活的T細(xì)胞6×106/只，注射過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞9d后，Daf1-/-的心臟排斥，而W

9、T的心臟存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)（其中之一于第12d排斥，其中之二超過20d）。在SCID小鼠血清中沒有檢測(cè)到抗-供體的抗體。
　　5.DAF影響CD8+效應(yīng)T細(xì)胞(TCL)功能。經(jīng)尾靜脈注射給C3H(H-2k)小鼠注射B6（H-2b）小鼠脾細(xì)胞（每只注射15×106個(gè)細(xì)胞），2周后分離被致敏的C3H小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞，分別以Daf1-/-、WT、C3-/-的B6（H-2b）小鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞（內(nèi)含APC），以ELISPOT檢測(cè)被致

10、敏的C3H小鼠T細(xì)胞再次接觸相同抗原的反應(yīng)。結(jié)果顯示，以Daf1-/-脾細(xì)胞刺激的C3H小鼠T細(xì)胞反應(yīng)最為強(qiáng)烈，其分泌INF-γ細(xì)胞數(shù)最高，為WT脾細(xì)胞刺激的2倍，C3-/-的最低。結(jié)果分別為:Daf1-/-878.5±270.9、WT389.8±53.5、C3-/-264.3±27.1（/1×105，x±S）（WT與C3-/-比較P＜0.01;Daf1-/-與C3-/-或WT比較P＜0.001）。
　　6.DAF影響抗原提呈細(xì)胞

11、(APC)對(duì)抗原的處理能力。源自WT或Daf1-/-的B6小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞作為APC，與CD4+T細(xì)胞株及卵白蛋白OVA多肽(OVA323-339)或卵白蛋白OVA(濃度5～30μM/well)共培養(yǎng)24Hr后，離心取上清液，以CTLL分析檢測(cè)上清液中T細(xì)胞活化后產(chǎn)生的IL-2的相對(duì)單位。結(jié)果如圖所示，與WT相比，源于Daf1-/-小鼠巨噬細(xì)胞攝取、處理卵白蛋白OVA并提呈特異性抗原給T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的量，顯著增高(P＜0.0001

12、)，但對(duì)于卵白蛋白OVA多肽(OVA323-339)，兩者差異無顯著性(P＞0.05)。同樣，以CD8+T細(xì)胞株與卵白蛋白OVA多肽(OVA257-264)或不同濃度的卵白蛋白OVA共培養(yǎng)24Hr后，離心取上清液，以CTLL分析檢測(cè)上清液中T細(xì)胞活化后產(chǎn)生的IL-2的量，結(jié)果與CD4+T細(xì)胞株的相似。
　　結(jié)論：
　　1.供體缺乏DAF不僅加速移植排斥反應(yīng)，且明顯增強(qiáng)抗供體特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。
　　2.受體缺乏DAF對(duì)