轉(zhuǎn)染DLC1基因?qū)θ寺殉舶㎡VCAR-3細胞增殖和遷移能力的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 卵巢癌作為婦科三大惡性腫瘤之一,其死亡率遠遠超出宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌,位居婦科惡性腫瘤之首。其具有起病隱匿,病程短,易早期侵襲、轉(zhuǎn)移等特點,目前雖應(yīng)用手術(shù)、化療等治療方法,但其長期生存率卻無明顯改善。因此尋找有效的抑制卵巢癌發(fā)生發(fā)展的基因治療靶點成為其研究的熱點。肝癌缺失基因-1(ddeteA in liver cancer1,DLC1)位于人類染色體8p21.3-22區(qū)域上,在多種腫瘤中通過雜合性缺失和(或)

2、啟動子甲基化而低表達或不表達。DLC1蛋白為Rho GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activatiog protein,Rho GAP),主要通過其Rho GAP區(qū)域調(diào)控Rho蛋白(RhoA、Cdc42)及其下游效應(yīng)因子活性,抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。在人肝癌細胞中DLC1導(dǎo)致FAK(Y925)去磷酸化,通過抑制FAK-Ras-MAPK通路,抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。JNK蛋白在卵巢癌中通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的表達,

3、參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展。目前關(guān)于DLC1基因與卵巢癌增殖和遷移關(guān)系,及DLC1與FAK、JNK的關(guān)系的報道尚少。
　　 該研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將重組質(zhì)粒pEGFP-C3-DLC1和空質(zhì)粒pEGFP-C3分別轉(zhuǎn)染不表達DLC1基因的人卵巢癌細胞OVCAR-3,觀察DLC1基因?qū)β殉舶┘毎鲋?、細胞周期和遷移能力的影響及其相關(guān)分子機制,初步探討其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用,及其作為卵巢癌基因治療靶點的意義。
　　

4、 方法:
　　 1、提純重組質(zhì)粒pEGFP—C3-DLC1,雙酶切鑒定質(zhì)粒的正確性。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-C3-DLC1及空質(zhì)粒pEGFP-C3轉(zhuǎn)染人卵癌癌細胞OVCAR-3；實驗分三組:OVCAR-3組,OVCAR-3-EGFP組和OVCAR-3-DLC1組。G418篩選單克隆后,采用RT-PCR及Western blotting方法檢測轉(zhuǎn)染前后三組細胞DLC1mRNA和蛋白的表達情況,觀察轉(zhuǎn)染效果；
　　

5、 2、采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法、流式細胞儀和Transwell小室分別觀察轉(zhuǎn)染前后三組OVCAR-3細胞增殖、細胞周期和遷移能力的變化,分析DLC1基因?qū)VCAR-3細胞增殖和遷移能力的影響；
　　 3、采用Western blotting技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后三組OVCAR-3細胞中FAK、JNK蛋白及其磷酸化水平的變化,分析DLC1基因發(fā)揮作用的分子機制；
　　 4、應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料

6、多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及bonferroni法檢驗。計量資料相關(guān)性分析行Pearson相關(guān)性分析。以雙側(cè)a=0.05為檢驗水準。
　　 結(jié)果:
　　 1、雙酶切鑒定重組質(zhì)粒出現(xiàn)4.7Kb和3.9Kb兩條特異性條帶,分別為pEGFP-C3和DLC1cDNA,證明插入序列正確。在OVCAR-3細胞中未見DLC1mRNA和DLC1蛋白表達,轉(zhuǎn)染DLC1基因后可檢測到DLC1 mRN

7、A和DLC1蛋白的穩(wěn)定表達。
　　 2、轉(zhuǎn)染DLC1基因后OVCAR-3-DLC1組細胞體外增殖能力自第2天起均低于其余兩組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在培養(yǎng)6天后OVCAR-3-DLC1組細胞的A492值為0.503±0.022,與OVCAR-3-EGFP(1.106±0.031)、OVCAR-3組(1.132±0.045)相比,F=1604.000,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、流式細胞檢

8、測細胞周期結(jié)果顯示:OVCAR-3、OVCAR-3-EGFP、OVCAR-3-DLC1細胞的細胞周期G0／G1期、S期、G2／M期的比例分別為(55.06±0.73)％、(23.24±0.42)％、(23.60±0.46)％,(56.22±0.51)％、(18.96±0.35)％、(23.77±0.57)％和(61.40±0.75)％、(17.10±0.44)％、(21.50±0.20)％,三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.151

9、,P=0.000；F=1619.000,P=0.000；F=25.052,P=0.001)。OVCAR-3-DLC1組細胞與其他兩組相比G0／G1期細胞比例顯著增加,S期比例顯著降低。
　　 4、Transwell法細胞遷移實驗結(jié)果顯示:OVCAR-3-DLC1、OVCAR-3-EGFP和OVCAR-3組穿過濾膜孔的細胞分別為(40.27±2.15)、(56.80±2.04)、(57.07±3.01),三組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

10、(F=233.13,P=0.00)。OVCAR-3-DLC1組細胞的遷移細胞數(shù)顯著少于兩對照組。
　　 5、OVCAR-3-DLC1、OVCAR-3-EGFP和OVCAR-3三組細胞中p-FAK(Y925)、p-JNK(Thr183／Tyr185)蛋白相對表達量分別為0.63±0.06,0.70±0.05,0.72±0.04；1.78±0.11,2.37±0.11,2.41±0.15,在OVCAR-3-DLC1組中兩蛋白的表達量

11、顯著低于兩對照組(F=9.186,P=0.001；F=93.729,P=0.000),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。但FAK、JNK蛋白的表達水平無明顯變化(P>0.05),差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6、采用Pearson相關(guān)性分析表明p-FAK、p-JNK與OVCAR-3細胞增殖(r=0.41,P=0.02；r=0.39,P=0.03)和遷移(r=0.36,P=0.04；r=0.37,P=0.03)能力顯著相關(guān),但與OVCAR-3細胞周

12、期無明顯相關(guān)性(r=-0.08,P=0.77；r=-0.00,P=1.00)。
　　 結(jié)論:
　　 1、DLC1基因可部分通過G1／S檢驗點起阻滯作用,從而抑制卵巢癌細胞的體外增殖能力。
　　 2、DLC1基因可抑制卵巢癌細胞體外遷移能力。
　　 3、在卵巢癌細胞中DLC1蛋白可通過使p-FAK(Y925)、p-JNK(Thr183／Tyr185)蛋白脫磷酸化,抑制卵巢癌細胞體外增殖和遷移能力,其可能通過