CDKN3基因?qū)ι掀ば月殉舶┰鲋澈颓忠u能力影響的相關(guān)研究.pdf

1、前言：
　　卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢惡性腫瘤90％～95％為原發(fā)性，其中以上皮性癌最常見，起病隱匿，晚期病變常于盆腹腔內(nèi)種植播散，85％以上的晚期患者在2-3年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)性卵巢癌化療耐藥性明顯增加，使用化療藥物緩解率不足30％，5年生存率低于30％，整體預(yù)后很差。目前仍缺乏特異的生物學(xué)標(biāo)記物用于其早期診斷及預(yù)后判斷。因此，尋找有關(guān)卵巢癌早期診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后判斷的新

2、指標(biāo)和新的、特異性強(qiáng)的卵巢癌治療靶點，提高卵巢癌患者生存率，是目前卵巢癌研究中至關(guān)重要的課題。
　　細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(Cyclin-dependent kinase inhibitor3，CDKN3)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子中的一種，作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)。CDKN3基因1995年被定位于14q22，基因大小約24Kbs，共含有9個外顯子。CDKN3基因的蛋白產(chǎn)

3、物含有212個氨基酸，是一種雙重特異性蛋白磷酸酶。體外實驗表明CDKN3含有酪氨酸磷酸酶特異的HCXX-XXGR結(jié)構(gòu)域，可以使磷酸化的酪氨酸(Tyrosine，Tyr)和蘇氨酸(Threonine，Thr)去磷酸化。在正常的細(xì)胞周期中CNKN3主要是作為CDK2的抑制因子，在G1-S期與CDK2穩(wěn)定結(jié)合，來參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，阻滯細(xì)胞周期。CDK2的充分活化需要的Thr160的磷酸化和Tyr15、Thr14的去磷酸化，而pThr160的

4、去磷酸化是CDK2失活的關(guān)鍵。CDKN3通過其C-末端螺旋與CDK2C-末端的葉狀結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使CDK2 T環(huán)處的pthr-160區(qū)域伸展暴露，完成去磷酸化。CDKN3被證實在多種人類惡性腫瘤中表達(dá)異常，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、宮頸癌、腎癌、腦瘤等，其過表達(dá)往往與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為和腫瘤分期、組織學(xué)分級、生存預(yù)后等臨床病理特征相關(guān)，因此針對CDKN3的抗癌治療有一定的臨床價值，深入研究其作用機(jī)理將為腫瘤治療提供新的策略，有

5、望成為新的診斷腫瘤、判斷預(yù)后的標(biāo)志物和基因治療靶點。
　　目的：
　　本研究旨在探討CDKN3在上皮性卵巢癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況及與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，為臨床治療提供新的思路及依據(jù)。研究的第一部分我們在細(xì)胞和組織水平上檢測CDKN3的表達(dá)水平，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;研究的第二部分，通過RNAi技術(shù)下調(diào)CDKN3表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞株，觀察對其增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響;研究的第三

6、部分，通過RNAi技術(shù)下調(diào)CDKN3表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞株，觀察對其遷移、侵襲能力的影響，揭示CDKN3與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討CDKN3潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1、實驗對象
　　97例有完整病理資料和完整隨訪資料的我院病理科石蠟包埋留存上皮性卵巢癌組織標(biāo)本。30例上皮性卵巢癌新鮮組織標(biāo)本和30例對照組新鮮正常卵巢組織采自于手術(shù)切除30分鐘內(nèi)。上皮性卵巢癌細(xì)胞株OVACR3、HO89

7、10M、SKOV3由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所惠贈。
　　2、實驗方法
　　(1)免疫組織化學(xué)檢測97例上皮性卵巢癌和30例正常卵巢組織中CDKN3蛋白表達(dá)。
　　(2) Real Time PCR檢測CDKN3基因mRNA在30例上皮性卵巢癌和30例正常卵巢組織中的表達(dá)。
　　(3) Western blot檢測CDKN3蛋白在30例上皮性卵巢癌和30例正常卵巢組織中的表達(dá)。
　　(4)細(xì)胞培養(yǎng):人上皮性卵巢

8、癌細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)。
　　(5)免疫熒光檢測CDKN3在上皮性卵巢癌細(xì)胞中的定位。
　　(6)應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)靶基因CDKN3的表達(dá)。
　　(7)應(yīng)用平板克隆實驗檢測CDKN3表達(dá)下調(diào)后上皮性卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。
　　(8)應(yīng)用CCK8檢測CDKN3表達(dá)下調(diào)后上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖能力的變化。
　　(9)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CDKN3表達(dá)下調(diào)后上皮性卵巢癌細(xì)胞周期和凋亡情況的變化。
　　(10

9、)應(yīng)用Transwell實驗檢測CDKN3表達(dá)下調(diào)后上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲能力變化。
　　結(jié)果：
　　1、CDKN3基因在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義
　　(1)免疫組化檢測結(jié)果說明上皮性卵巢癌組織CDKN3表達(dá)水平與正常卵巢組織比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;結(jié)合臨床資料進(jìn)一步研究表明CDKN3高表達(dá)與腫瘤分期、術(shù)后殘留癌灶密切相關(guān)(P＜0.05);患者年齡、腫瘤分化及腫瘤組織學(xué)類型無明顯相關(guān)(P＞0.05)

10、。
　　(2) Real Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示，CDKN3在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于正常卵巢組織(P＜0.05)，進(jìn)一步實驗顯示在卵巢癌細(xì)胞株OVACR3中表達(dá)顯著升高。
　　2、CDKN3基因表達(dá)下調(diào)后對上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響
　　(1)選取CDKN3高表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞株OVACR3，免疫熒光結(jié)果顯示CDKN3蛋白于細(xì)胞核、細(xì)胞漿皆有表達(dá)。
　　(2)

11、下調(diào)CDKN3基因表達(dá)后，平板克隆實驗及CCK8檢測結(jié)果表明OVACR3細(xì)胞克隆形成能力和增殖能力下降，細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示OVACR3細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，細(xì)胞凋亡不受影響。
　　3、CDKN3基因表達(dá)下調(diào)后對上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　下調(diào)CDKN3基因表達(dá)后，Transwell實驗結(jié)果顯示OVACR3細(xì)胞遷移、侵襲能力無明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1.CDKN3基因在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞