包膜RNA技術(shù)及其在輸血傳染病預(yù)防和控制中的應(yīng)用.pdf

1、隨著無償獻(xiàn)血的推廣和新技術(shù)的應(yīng)用，血液的安全性已經(jīng)有了較大的提高，但輸血傳播感染性疾病的殘留風(fēng)險仍不可避免。血液篩查中引入核酸檢測以及病原體滅活新技術(shù)的應(yīng)用能進(jìn)一步降低輸血?dú)埩麸L(fēng)險，但兩者在實際應(yīng)用中都缺乏安全、穩(wěn)定、有效的質(zhì)控品或評價物來保障結(jié)果的可靠性。
　　 包膜RNA技術(shù)能將一定長度的外源核酸片段包裝到MS2噬菌體包膜中，從而制備出含有特異性RNA片段的假病毒顆粒，可以為血液核酸檢測和病原體滅活提供安全、穩(wěn)定的質(zhì)控品或評

2、價物。
　　 本研究首先克隆MS2噬菌體中裝配蛋白、包膜蛋白和PAC位點到表達(dá)載體，體外表達(dá)出具有RNA酶抗性的假病毒顆粒，建立包膜RNA技術(shù)平臺。在該平臺的基礎(chǔ)上，插入一定長度的外源序列，并通過體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)出含有該外源序列的假病毒顆粒。結(jié)果顯示，外源序列無論是200bp左右的短序列，還是1400bp左右的長片段序列，表達(dá)出來的假病毒顆粒均含有完整的外源插入序列。同時，該假病毒顆粒依然具備MS2噬菌體的穩(wěn)定性，外層的包膜可以有效

3、保護(hù)內(nèi)部MS2片段以及外源片段不被RNA酶所降解。因此該假病毒顆粒相對于真實的病毒無增殖性和感染性，安全性更高；相對于裸露的RNA片段有更好的穩(wěn)定性，不易核酸酶所降解。
　　 本研究首先討論了假病毒顆粒作為核酸檢測質(zhì)控品的可行性。研究中構(gòu)建了含有丙型肝炎病毒(HCV)保守區(qū)440bp外源序列的假病毒顆粒，還構(gòu)建了同時含有HCV、人類免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)三種病原體保守區(qū)片段的假病毒顆粒，并使用匹基公司和科

4、華公司商品化試劑盒對假病毒顆粒進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，假病毒顆粒可以有效模擬真實病毒，檢測特異性強(qiáng)。此外，假病毒顆粒作為質(zhì)控品相對于真實病毒和體外轉(zhuǎn)錄RNA有更好的穩(wěn)定性和安全性，保存效果更好。
　　 本研究隨后討論了假病毒顆粒作為評價物在熒光定量PCR病原體滅活有效性驗證中應(yīng)用的可行性。研究使用包膜RNA技術(shù)平臺構(gòu)建了含Sindbis病毒1400bp的假病毒顆粒，采用亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活方法對Sindbis病毒和Sindbis假病毒

5、顆粒同時進(jìn)行了滅活處理，比較分析Sindbis病毒感染性與核酸損傷之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，經(jīng)過亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理后的Sindbis病毒，其感染性隨著光照時間的增長而逐漸降低，同時其核酸的損傷程度也隨著光照時間的增長而逐漸增強(qiáng)，Sindbis病毒感染性降低與核酸降低量呈線性相關(guān)性。另一方面，經(jīng)亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理后的Sindbis假病毒顆粒，其核酸損傷程度隨著光照時間的增長而逐漸增強(qiáng)，通過與Sindbis病毒核酸損傷的比較得出，Sindb

6、is病毒與Sindbis假病毒顆粒核酸降低量也成線性相關(guān)性。由此，通過假病毒顆粒中核酸降低量可以間接反映出病毒的滅活效果，假病毒顆粒在亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活中作為熒光定量PCR驗證方法的評價物具有一定的可行性。
　　 包膜RNA技術(shù)所制備的假病毒顆粒不僅為血液核酸檢測提供了安全、穩(wěn)定、高效的質(zhì)控品，也為熒光定量PCR方法評價病原體滅活的有效性提供了實用的評價物。相信隨著相關(guān)技術(shù)在采供血實踐中的推廣，包膜RNA技術(shù)及其制備的假病毒顆粒將