青蒿鱉甲湯干預(yù)BMSCs對(duì)AMLP-CR患者BMNC來源DCs誘導(dǎo)的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的方法，將達(dá)到完全緩解標(biāo)準(zhǔn)的急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓中分離出去T細(xì)胞的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(TD-BMNC)、BMSCs分別與青蒿鱉甲湯含藥血清培養(yǎng)，再將與含藥血清共同培養(yǎng)過的TD-BMNC來源的DCs與BMSCs共同培養(yǎng)，觀察含藥血清對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)分化成熟的影響。用此法誘導(dǎo)分化的樹突狀細(xì)胞(DC)與純化的正常人和緩解期患者外周血T細(xì)胞共同培養(yǎng)，得到激發(fā)T細(xì)胞，用激發(fā)的T細(xì)胞與白血病細(xì)胞株(K562)共同培育，以M

2、TT法測(cè)定該T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞株的殺傷活性，探討青蒿鱉甲湯能否通過干預(yù)AML-CR患者BMSCs從而對(duì)其骨髓單個(gè)核細(xì)胞來源的DC誘導(dǎo)作用產(chǎn)生影響。
　　 方法：1.應(yīng)用洗滌細(xì)胞、離心程序在AML-CR患者的骨髓中分離出BMSCs，加入青蒿鱉甲湯不同劑量含藥血清組的25cm2培養(yǎng)瓶中，放置在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，于接種3d后首次半量換液，以后隔日換液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況并拍照；2.應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)

3、程序從AML-CR患者骨髓中分離出去T細(xì)胞的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(TD-BMNC)，用含IO％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整TO-BMNC細(xì)胞濃度后加入24孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)9d，隔日換液1次，以不同濃度中藥含藥血清、中藥含藥血清聯(lián)合細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-4、TNF-α)、細(xì)胞因子、空白血清組分別培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞的形態(tài)，并拍照。3.用FITC標(biāo)記的CD29、CD44及CD-1a、HLA-DR、CD86抗體分別標(biāo)記BMSCs

4、及DCs，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組各抗體的表達(dá)率。4.收集培養(yǎng)9d后的BMSCs與DCs，用RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至10×106/ml混合培養(yǎng)5d；5.分別收集純化的同種異體T細(xì)胞、AML-CR患者自體T細(xì)胞、BMSCs與AML-CR患者TD-BMNC來源的DC以10:1比例加入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)5d，培養(yǎng)基中加入100U/ml的IL-2進(jìn)行同種異體T細(xì)胞及自體T細(xì)胞的激發(fā)。6.激發(fā)后的各組T細(xì)胞與K562細(xì)胞分別以10:1、20:1、

5、40:1效：靶比例培養(yǎng)24h，MTT法檢測(cè)不同條件培養(yǎng)的DC誘導(dǎo)T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1.用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)青蒿鱉甲湯含藥血清組、含藥血清聯(lián)合細(xì)胞因子組、細(xì)胞因子組BMSCs、DC的形態(tài)無差別。
　　 2.從BMSCs的免疫分子檢測(cè)顯示，AML-CR患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細(xì)胞表型的BMSCs，含藥血清與細(xì)胞因子在誘導(dǎo)CD29、CD44表達(dá)方面無協(xié)同作用，是

6、否細(xì)胞因子對(duì)BMSCs的分化無影響，是否對(duì)兔子內(nèi)環(huán)境有干預(yù)作用，均有待于進(jìn)一步研究。
　　 3.從DC的免疫分子檢測(cè)顯示，AML-CR患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細(xì)胞表型的DC。從本實(shí)驗(yàn)的總的趨勢(shì)看，青蒿鱉甲湯含藥血清配合細(xì)胞因子培養(yǎng)誘導(dǎo)DC，其特異性表面抗原的表達(dá)高于青蒿鱉甲湯含藥血清及細(xì)胞因子培養(yǎng)誘導(dǎo)的DC，說明細(xì)胞因子和青蒿鱉甲湯含藥血清在誘導(dǎo)TD-BMNC轉(zhuǎn)化DC上有協(xié)同作用，可能為

7、含藥血清改善了細(xì)胞因子的功能和內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)了DC的誘導(dǎo)、分化。
　　 4.在本實(shí)驗(yàn)中，各組激活T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞均有殺傷作用，各效靶比中各組別對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率普遍優(yōu)于空白組；表明青蒿鱉甲湯干預(yù)的含藥血清誘導(dǎo)的DC有效的提呈了腫瘤抗原；并活化T細(xì)胞，致使它成為抗原特異性的CTL，能夠特異性的殺傷K562腫瘤細(xì)胞。青蒿鱉甲湯與細(xì)胞因子有協(xié)同作用，可能青蒿鱉甲湯含藥血清誘導(dǎo)、強(qiáng)化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌了多種的細(xì)胞因子，這些因子改變

8、了機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，最終影響了DC細(xì)胞對(duì)K562的殺傷作用；從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看異體T細(xì)胞殺傷率優(yōu)于自體的T細(xì)胞的殺傷率，可能是白血病腫瘤免疫逃逸機(jī)制主要是白血病緩解后患者 T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能受損嚴(yán)重有關(guān)，有待進(jìn)一步大樣本實(shí)驗(yàn)研究。各組別對(duì)K562細(xì)胞均有殺傷作用，但就本實(shí)驗(yàn)而言，效靶比與殺傷率之間沒有一定的規(guī)律可循，這與文獻(xiàn)報(bào)道的殺傷作用隨效靶比的增加而增加不符，有待以后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　 5.從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，青蒿鱉甲湯含藥血清低

9、劑量組培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs、DC的特異性細(xì)胞表面抗原表達(dá)率高于中、高劑量組，抗原表達(dá)不因劑量增加而升高，說明低劑量青蒿鱉甲湯含藥血清可能是此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度，但是在各組激活T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用中，青蒿鱉甲湯低、中、高劑量之間的卻無一定規(guī)律可循，因此低劑量青蒿鱉甲湯含藥血清是否為最佳濃度仍有待于進(jìn)一步研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性髓系白血病完全緩解患者骨髓經(jīng)青蒿鱉甲湯含藥血清誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得具備典型特征和細(xì)胞表