B19病毒XA株VPu真核表達(dá)系統(tǒng)的建立、鑒定及其免疫作用的研究.pdf

1、人細(xì)小病毒B19（HumanparvovirusB19）屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)以來，諸多研究證明諸多疾病的發(fā)生伴隨著B19病毒的感染。
　　B19病毒由一個(gè)二十面體衣殼蛋白包裹一條單鏈DNA（5596bp）組成。是一種無包膜且有許多理化耐受性的病原體，用一般的病毒滅活方法不能阻止其傳播。B19病毒基因編碼一個(gè)主要的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）、兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1和VP2）和兩個(gè)小分子量蛋白（7.5kD

2、a和11kDa）。VP1蛋白（83kDa）蛋白末端比VP2蛋白（58kDa）多出227個(gè)氨基酸。VP1u蛋白既由這227個(gè)氨基酸所組成。VP1u蛋白具有PLA2酶活性，能夠水解脂肪酸和磷脂，刺激機(jī)體出現(xiàn)免疫紊亂。VP1u蛋白的大部分片段暴露于到病毒表面，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。VP1u蛋白在B19病毒感染發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，也有可能成為B19疫苗的首選抗原之一。
　　B19病毒XA株VP1u核苷酸存在著變異，鑒于VP1u蛋

3、白的上述特殊的作用，B19病毒XA株VP1u具有其獨(dú)特的免疫學(xué)特點(diǎn)。2009年,我們研究證實(shí)，B19病毒XA株VP1u蛋白免疫動(dòng)物后可引起動(dòng)物心臟、肝臟、關(guān)節(jié)滑膜等組織發(fā)生病理改變，并可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等酶系的升高。這可能與VP1u蛋白的PLA2活性有關(guān)，也可能與VP1u蛋白免疫動(dòng)物后蛋白與動(dòng)物細(xì)胞蛋白間的分子交叉反應(yīng)有關(guān)。這對(duì)VP1u蛋白作為

4、B19病毒疫苗的可行性帶來了疑問，鑒于核酸疫苗與普通蛋白疫苗不同,其能在自體細(xì)胞中產(chǎn)生外源性蛋白,這種蛋白更像天然分子的蛋白的抗原提成過程與自然感染十分相似，并且可以引發(fā)宿主長(zhǎng)久的免疫應(yīng)答，因此，我們進(jìn)行了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建B19病毒VP1u基因真核表達(dá)載體，通過基因測(cè)序及真核轉(zhuǎn)染鑒定VP1u蛋白表達(dá)。而后以B19病毒XA株VP1u基因?yàn)榘谢驑?gòu)建的真核表達(dá)載體免疫動(dòng)物。對(duì)免疫后小鼠心肌組織進(jìn)行

5、病理檢查；通過流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分子數(shù)量變化；ELISA法檢測(cè)免疫后小鼠血清中抗體表達(dá)情況，判斷其作為核酸疫苗的可能性。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u的構(gòu)建從已構(gòu)建好的B19病毒XA株原核表達(dá)載體中獲得VP1u基因，將其克隆入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證后，獲得真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-VP1u。
　　2

6、.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u真核轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,Westernblot和免疫熒光檢測(cè)VP1u蛋白的表達(dá)。
　　3.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫學(xué)研究將重組載體pIRES2-EGFP-VP1u及pIRES2-EGFP空質(zhì)粒及生理鹽水分別采用肌肉注射的方法免疫BABL/c小鼠。通過流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量，westernblot及ELI

7、SA方法檢測(cè)小鼠血清中B19VP1u抗體，并對(duì)免疫后小鼠心肌組織行光鏡和電鏡檢查，判斷其作為核酸疫苗的可行性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達(dá)載體，經(jīng)過雙酶切鑒定和基因測(cè)序鑒定證明與我們保存的pQE30-VP1u原核表達(dá)載體中的VP1u核苷酸相同，沒有產(chǎn)生堿基突變。
　　2.經(jīng)過真核轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u至HeLa細(xì)胞，免疫熒光觀察和West

8、ernblot技術(shù)檢測(cè)證實(shí)，可表達(dá)VP1u蛋白。
　　3.經(jīng)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫的BABL/c小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的變化，在接種疫苗第二、三個(gè)月發(fā)生明顯變化，第四個(gè)月后CD4+T細(xì)胞逐漸回復(fù)正常，而CD8+分子未產(chǎn)生明顯變化。小鼠心肌組織經(jīng)光鏡及電鏡檢查未提示病理變化。通過我們構(gòu)建的ELISA檢測(cè)體系可檢測(cè)到特異的抗B19病毒VP1u抗體。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了B19

9、病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達(dá)載體，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可在Hela細(xì)胞中表達(dá)VP1u蛋白。
　　2.重組質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠后，經(jīng)ELISA檢測(cè)能產(chǎn)生特異性抗體，心肌組織經(jīng)光鏡和電鏡檢查未發(fā)現(xiàn)病理變化，提示重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物后未引起自身免疫紊亂。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4+和CD8+TT細(xì)胞數(shù)量后，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u可以使免疫動(dòng)物脾臟脾淋巴細(xì)胞CD4+T細(xì)胞發(fā)生變