結(jié)締組織生長(zhǎng)因子多肽納米分子探針的生物活性及靶向性研究.pdf

1、研究目的：本研究利用自己實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并制備的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子多肽（自行命名為Plc，專利申請(qǐng)?zhí)?00910025731.0）通過化學(xué)修飾的方法制備結(jié)締組織生長(zhǎng)因子多肽超小超順磁氧化鐵納米粒子（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）探針（Plc-USPIO），檢測(cè)其生物活性及細(xì)胞毒性，同時(shí)對(duì)其整合素αvβ3靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而為臨床αvβ3靶向磁共振成像、動(dòng)態(tài)研究血管形成相關(guān)病理過程的發(fā)

2、生發(fā)展機(jī)制、診療提供新方法。
　　 研究方法：1.通過化學(xué)連接劑乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride，EDC），將Plc與二巰基丁二酸（meso-2，3-dimercaptosuccinic acid，DMSA）包被的超小超順磁氧化鐵納米粒子以生成化學(xué)共價(jià)鍵的形式相結(jié)合，形成分子探針Plc-USPIO；通過固相結(jié)

3、合試驗(yàn)（solidphase binding assay）檢測(cè)分子探針活性；采用體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，運(yùn)用CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒檢測(cè)該分子探針的細(xì)胞毒性。2.通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)人肝癌Bel7402細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)情況；將合成的分子探針與Bel7402細(xì)胞共孵育后通過普魯士藍(lán)染色、透射電鏡及磁共振成像等方法對(duì)分子探針進(jìn)行體外細(xì)胞水平αvβ3靶向性檢測(cè)。3.用人肝癌Bel7402細(xì)

4、胞株建立裸鼠肝癌模型，用1.5 T磁共振儀平掃及靜脈給予分子探針后采集圖像，觀察該分子探針在體對(duì)高表達(dá)αvβ3腫瘤的靶向性。
　　 結(jié)果：1.應(yīng)用EDC法制備成Plc超小超順磁氧化鐵納米分子探針，固相結(jié)合試驗(yàn)方法所得的吸光度（OD）值與非特異性抗菌肽-USPIO組及未結(jié)合多肽的USPIO組相比差異顯著（P<0.05）；通過CCK-8試劑盒測(cè)得吸光度（OD）值并進(jìn)行毒性評(píng)級(jí)，結(jié)果顯示各不同濃度的Plc-USPIO組與陰性對(duì)照組（1

5、640培養(yǎng)液）比較均無顯著差異（P>0.05），同時(shí)該合成材料毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，屬于無細(xì)胞毒性范疇。2.免疫細(xì)胞化學(xué)顯示Bel7402細(xì)胞整合素αvβ3表達(dá)呈陽性；普魯士藍(lán)染色可見，只含血清1640培養(yǎng)液的單純細(xì)胞組，細(xì)胞內(nèi)基本無藍(lán)色鐵顆粒出現(xiàn)，標(biāo)記Plc超小超順磁納米粒子組與未結(jié)合多肽的USPIO組及Plc競(jìng)爭(zhēng)組相比，細(xì)胞內(nèi)可見大量藍(lán)色鐵顆粒；通過透射電鏡技術(shù)（transmissionelectron microscopy，TEM）觀察

6、Plc-USPIO及未結(jié)合多肽的USPIO與Bel7402細(xì)胞共孵育后在細(xì)胞亞器官的分布，前者在細(xì)胞胞漿及溶酶體內(nèi)均可見到電子致密物沉積，后者在細(xì)胞內(nèi)未見到電子致密物沉積；通過1.5 T磁共振儀掃描結(jié)果示，Plc-USPIO各組及未結(jié)合多肽的USPIO各組與單純細(xì)胞組相比在T2*WI序列上信號(hào)強(qiáng)度呈不同程度降低（P<0.05）；同時(shí)Plc-USPIO各濃度組與對(duì)應(yīng)濃度未結(jié)合多肽的USPIO組相比信號(hào)強(qiáng)度也有顯著減低（P<0.05）。3.

7、在體磁共振成像顯示，荷瘤鼠給予未結(jié)合多肽的USPIO后，腫瘤部位信號(hào)強(qiáng)度較平掃時(shí)無明顯下降（P>0.05）；Plc-USPIO組腫瘤部位信號(hào)強(qiáng)度較平掃時(shí)明顯降低（P<0.05），且較給予未結(jié)合多肽USPIO組腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度顯著降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：EDC化學(xué)合成方法可制備出Plc超小超順磁氧化鐵納米分子探針，同時(shí)其仍具有生物活性而無細(xì)胞毒性；合成的分子探針對(duì)高表達(dá)αvβ3的Bel7402細(xì)胞及在體腫瘤具有良好靶