激光誘導小鼠脈絡膜新生血管中C9的表達及CVF干預的實驗研究.pdf

1、目的： 年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是引起中老年人低視力和盲的主要原因之一，脈絡膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)的形成是AMD致盲的首要原因。本課題選擇玻璃膜疣所含成分—補體膜攻擊復合物(membrane attack complex，MAC)，以激光誘導的小鼠CNV模型，觀察MAC在CNV形成中的表達及作用，并用補體消

2、耗劑蛇毒因子(cobravenomfactor，CVF)腹腔注射干預CNV形成。探索補體激活與CNV的關系，進一步闡釋AMD的免疫學相關機制，為CNV的治療提供理論依據(jù)和新方法。 方法： 1.選擇36只C57BL/6J小鼠，6-8周大，體重25-30g，雌雄不限，均經(jīng)直接檢眼鏡、裂隙燈檢查后無眼部疾病。隨機分為三組，一組為對照組(n=12)；二組為CVF干預組(n=12)：自激光光凝前2天及激光光凝后，每天對小鼠腹腔注射

3、0.1μg/gCVF；三組為單純激光光凝組(n=12)。 2.CNV模型制造：小鼠腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉，復方托品酰胺散瞳，愛爾凱因點眼表面麻醉，實驗眼結膜囊內(nèi)滴適量1％甲基纖維素，眼前放置載玻片作為角膜接觸鏡，能量設置：氪紅激光(波長647nm)，光斑直徑50μm，曝光時間0.1s，輸出功率能量120mw，在后極部打4個激光斑，距視盤約2視盤直徑，光凝后有氣泡產(chǎn)生為擊破Bruch膜的標志，直接檢眼鏡觀

4、察眼底激光斑。 3.分別在1、3、5、7天取出眼球，行冰凍切片，利用SABC-FITC免疫熒光染色方法觀察激光區(qū)域染色陽性情況，連續(xù)冠狀切片后，每只眼球選取2張激光區(qū)域完整視網(wǎng)膜結構分別行SABC-FITC熒光染色和HE染色，每張切片隨機選取5個視野(×200倍)，計數(shù)每個視野中補體9(complement9，C9)的累積光密度(integratedopticaldensity，IOD)，HE染色光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學變化。

5、 4.統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件后對單一處理組或單一時間點數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，對不同處理組不同時間點數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，用SNK法進行比較，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.HE染色 1組小鼠視網(wǎng)膜為正常視網(wǎng)膜，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜各層清晰，內(nèi)外核層排列規(guī)則，視網(wǎng)膜色素上皮層(retinalpigmentepithelium，RPE)，Bruch膜及脈

6、絡膜結構完整。2組小鼠視網(wǎng)膜光凝后1天光鏡下光凝區(qū)視網(wǎng)膜全層水腫，隆起B(yǎng)ruch膜和RPE層明顯破壞，視網(wǎng)膜內(nèi)、外層結構絮亂，部分缺失。光凝后3天光凝區(qū)視網(wǎng)膜依然水腫，隆起，可見移行增生的RPE細胞，脈絡膜毛細血管充血明顯，內(nèi)皮細胞增生，未見新生血管形成。光凝后7天光鏡下光斑區(qū)少量CNV形成。視網(wǎng)膜組織有水腫，輕度漿液性脫離，可見視網(wǎng)膜下形成瘢痕灶，瘢痕灶內(nèi)有細胞排列成不規(guī)則管腔樣結構，損傷部位RPE分解破碎。3組小鼠視網(wǎng)膜光凝后1天光

7、鏡下光凝區(qū)視網(wǎng)膜水腫較2組輕，余基本相同，光凝后3天光凝區(qū)視網(wǎng)膜依然水腫，脈絡膜毛細血管充血較2組輕，光凝后7天未見新生血管生成。 2.SABC-FITC組織免疫熒光染色不同處理組和不同時間點，對于小鼠C9的SABC-FITC染色的熒光強度表現(xiàn)不盡相同，經(jīng)方差齊性檢驗方差齊，成正態(tài)分布。在不同處理組和不同時間點經(jīng)雙因素方差分析，小鼠C9的IOD差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，尚可認為各處理組和各時間點小鼠C9的IOD不同；進

8、一步用SNK法行各組兩兩比較，除1，3組之間和B、C組之間小鼠C9的IOD差異沒有統(tǒng)計學意義外(P=0.990，P=0.999)，其他各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在單一處理組條件下，經(jīng)單因素方差分析，除1組，3組小鼠C9的IOD差異沒有統(tǒng)計學意義外(P=1.000，P=1.000)，其余組差異均有統(tǒng)計學意義，進一步行SNK法檢驗，除2組A，B與C組之間(P=0.993，P=0.924，P=0.917)，小鼠C9的IOD

9、差異沒有統(tǒng)計學意義外，其余各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在單一時間條件下，經(jīng)單因素方差分析，各組差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)進一步經(jīng)SNK法檢驗，除各時間段*與＃組小鼠C9的IOD差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.995，P=0.983，P=1.000，P=0.977)外，其余各組之間差異均有統(tǒng)計學意義。 結論： 本實驗成功建立了激光誘導C57BL/6J小鼠脈絡膜新生血管的動物模型，通過視網(wǎng)膜免疫熒光染色