MPTP對(duì)不同年齡快速老化小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)COX-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:探討1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl1，2，3，6tetrahydropyridine，MPTP)對(duì)不同月齡快速老化小鼠（senescence-acceleratedmouseprone8，SAMP8）急性損傷后黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)。進(jìn)一步來(lái)研究老化及外界環(huán)境毒物對(duì)帕金森病病理反應(yīng)過(guò)程的影響。
　　 方法:
　

2、　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制備
　　 選用健康雌性SAMP8小鼠3、6、10月齡各36只，隨機(jī)分為:生理鹽水對(duì)照組和MPTP用藥組各18只，小鼠背部皮下注射MPTP(Sigma，USA)，每次14mg·kg-1（生理鹽水溶），連續(xù)注射4次，每次間隔2h;對(duì)照組每次均注射等體積無(wú)菌生理鹽水。每組分別于第1次注射后1、3、7d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。
　　 2.行為學(xué)檢測(cè)
　　 2.1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

3、　　 采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠給藥后1、3、7d的自主活動(dòng)水平。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠置于方箱的正中央，觀察其5min內(nèi)活動(dòng)情況，記錄其垂直站立次數(shù)（前肢離開(kāi)地面1cm以上的次數(shù)）與水平穿格次數(shù)（三爪以上跨入鄰格）。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用90％酒精擦拭實(shí)驗(yàn)裝置，以免留下氣味影響其它小鼠。
　　 2.2.采用滾軸實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。
　　 用藥后第1天，第3天，第7天，分別以16、20、24、28、32rpm測(cè)定受試小鼠在轉(zhuǎn)軸上

4、滑落之前停留的時(shí)間，最長(zhǎng)測(cè)試時(shí)間為150s。記錄其停留時(shí)間，并計(jì)算overallrotarodperformance(ORP)值，公式為ORP=∑((a+b)/2)xc，其中a、b分別為動(dòng)物在較低和較高速度上停留的時(shí)間，c為相鄰兩個(gè)速度的差值。
　　 3.標(biāo)本留取
　　 體積分?jǐn)?shù)10％水合氯醛麻醉小鼠，從眼球取血，離心取血清;之后迅速斷頭取腦，在冰上剝離出中腦黑質(zhì)、紋狀體組織，電子天平稱重，置于液氮中冷凍。血清與組織均置

5、于-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 4.COX-2血清水平的檢測(cè)
　　 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定各組小鼠血清中COX-2的含量。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均采用復(fù)孔，最終反應(yīng)底物用酶標(biāo)儀比色測(cè)定。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=Ax(ˇ)2+Bx+C,A=-0.0003,B=0.0587,C=-0.1555;R=0.9990)。
　　 5.COX-2mRNA含量的檢測(cè)

6、>　　 采用半定量RT-PCR方法測(cè)定。①總RNA提取:按Trizol試劑說(shuō)明書要求，采用一步法提取總RNA。采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀觀察18S和28S兩條RNA條帶，鑒定RNA質(zhì)量;分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。②RT:取2μg總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求操作，合成eDNA。20μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:42℃60min，70℃10min。③PCR擴(kuò)增:COX-2基因上游引物為:5'-CAGCAAATCCTTGCTG

7、TTCC-3'，下游引物為:5'-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3';β-actin為內(nèi)參照，上游引物為:5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，下游引物為:5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為302bp;反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2min進(jìn)入循環(huán);94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，72℃延伸4min。④PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及半定量:產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)

8、量分?jǐn)?shù)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，計(jì)算COX-2條帶與β-actin條帶的光密度比值，并以此作為COX-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析其表達(dá)水平的變化。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s表示，各組間差異比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較使用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.行為學(xué)結(jié)果
　　 1.1.一般行為學(xué)表現(xiàn)及動(dòng)物死亡情況
　　 所有用藥組小鼠在接受MPTP注射總量達(dá)28mg·kg-1后，開(kāi)始出現(xiàn)豎毛、尾僵直、細(xì)小震顫等急性中毒癥狀，最后一次注射后小鼠出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、活動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)變慢等癥狀，以10月齡小鼠表現(xiàn)最為明顯。用藥1d后上述癥狀基本消失，但動(dòng)作仍少。用藥組6月齡小鼠死亡1只，10月齡小鼠死亡2只，3月齡小鼠無(wú)死亡。
　

10、　 1.2.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 與對(duì)照組相比，用藥組小鼠水平穿格次數(shù)與垂直站立次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）;與3、6月齡小鼠相比，10月齡小鼠在第1、3、7d次數(shù)下降更明顯，尤其是垂直站立次數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 1.3.滾軸實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組相比，用藥組小鼠在第1、3、7d轉(zhuǎn)軸上停留時(shí)間及ORP值均顯著減少，尤其注射MPTP后第1d，之后逐漸恢復(fù)，但仍然少于對(duì)照組（P＜0.01）;與3、6月齡小

11、鼠相比，10月齡小鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下降均最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.COX-2表達(dá)結(jié)果
　　 2.1.ELISA結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，用藥組小鼠COX-2表達(dá)從第1d開(kāi)始即明顯增高，并在第3d出現(xiàn)高峰，之后第7d略有下降（P＜0.05);與3、6月齡小鼠相比，各時(shí)間點(diǎn)10月齡小鼠COX-2表達(dá)水平升高最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.COX-2mRNA的表達(dá)
　　

12、 2.2.凝膠圖像分析顯示:不同月齡正常對(duì)照組的COX-2表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）;用藥組小鼠COX-2表達(dá)從第1d開(kāi)始即明顯增高，并在第3d出現(xiàn)高峰，之后第7d出現(xiàn)回落，但仍高于對(duì)照組;在第1、3、7d，10月齡小鼠COX-2表達(dá)水平升高最明顯，與3、6月齡相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.老化是影響帕金森病的重要因素，與環(huán)境毒素起到了協(xié)同作用。
　　 2.COX-2參與