人NR4A1基因重組腺病毒載體構(gòu)建及其在多囊卵巢綜合征病理機制研究中的初步應用.pdf

1、目的：NR4A1(又稱Nur77、TR3或NGFI-B)是甾體激素/甲狀腺激素/類維生素A受體超家族成員中的一員，其通常作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控基因的表達。在前期研究工作中，我們通過基因芯片雜交技術篩選出正常人和PCOS患者卵巢組織中290個差異表達的基因，NR4A1是該差異表達譜內(nèi)代表性基因之一，其在PCOS患者卵巢中表達下調(diào)(正常/PCOS=0.4)。既往大量的研究表明NR4A1在許多重要組織中均有表達，其功能涉及細胞凋亡/增殖、甾體激

2、素代謝、神經(jīng)信號傳導等諸多方面。但是，有關NR4A1在PCOS發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未有過報道。本研究通過構(gòu)建人NR4lAl基因重組腺病毒載體及小鼠卵泡體外培養(yǎng)的方法，實現(xiàn)NR4A1基因在小鼠卵泡膜細胞內(nèi)的超表達。在此基礎上，觀察NR4lAl基因超表達對卵泡膜細胞雄激素生成的影響。該研究為我們進一步探討NR4A1在PCOS復雜病理生理改變過程中的分子調(diào)控機制奠定了基礎。 方法：(1)周RT-PCR的方法從人卵巢組織中擴增NR4A

3、1基因全長，經(jīng)T/A克隆后，亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdtrack-NR4A1。pAdtrack-NR4Al經(jīng)酶切和測序鑒定后，用PmeⅠ酶切使其線性化，然后通過“兩步轉(zhuǎn)化法”分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1和穿梭質(zhì)粒pAdtrack-NR4A1轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細菌中進行同源重組得到AdCMV-NR4A1重組腺病毒質(zhì)粒。PacⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒AdCMV-NR4A1后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

4、染AD-293細胞進行病毒包裝和擴增。AdCMV-NR4A1轉(zhuǎn)染AD-293細胞2-3天后見GFP表達，轉(zhuǎn)染10～12 d后當90％以上細胞出現(xiàn)細胞病變(CPE)時，收集病毒上清。用收集的病毒上清再次感染AD-293細胞，重復感染四次，實現(xiàn)病毒大量擴增。最后，取1μl病毒上清進行PCR反應驗證上清中NR4A1基因的存在；抽提AdCMV-NR4A1感染的AD-293細胞蛋白，Western blot驗證NR4A1蛋白的表達。 (2)從20

5、日齡小鼠卵巢中分離并挑選出200μm的卵泡，置于96孔板中進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后挑選形態(tài)、色澤良好的卵泡轉(zhuǎn)移至新孔中，予AdCMV-NR4A1重組病毒直接加入卵泡培養(yǎng)液中感染卵泡膜細胞。病毒感染卵泡48小時后分別提取卵泡RNA及卵泡蛋白，通過RT-PCR及Western blot的方法驗證NR4A1在卵泡膜細胞中的超表達。同時，收集卵泡的條件培養(yǎng)液，用超敏感的固相放射免疫方法檢測培養(yǎng)液中睪酮的濃度，比較NR4A1超表達組及陰性對照

6、組睪酮值的差異。 結(jié)果：(1)用RT-PCR方法，從人卵巢組織中擴增出1797 bp的cDNA，測序證實為人NR4A1基因。在此基礎上，通過BJ-5183細菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了NR4A1基因的重組腺病毒質(zhì)粒AdCMV-NR4A1及對照質(zhì)粒AdCMV。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細胞后經(jīng)過包裝、擴增最終得到高滴度重組病毒，以GFP為標志測定AdCMV-NR14A1病毒滴度為107U/ml，AdCMV病毒滴度為108 U/ml。(2

7、)成功建立小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)的方法，小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)4天，達90％～X上的成活率。借助小鼠卵泡體外培養(yǎng)模型，實現(xiàn)了NR4A1在卵泡膜細胞內(nèi)超表達。與對照組相比，在NR4A1超表達組中NR4A1 mRNA和蛋白的表達水平均升高，兩組間差異顯著(p<0.05)。最后，用RIA檢測NR4A1在小鼠卵泡膜細胞內(nèi)超表達后睪酮分泌的變化，結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組中睪酮濃度明顯降低，兩組間差異顯著(p<0.05)，該結(jié)果表明NR4A1在小

8、鼠卵泡膜細胞內(nèi)超表達明顯抑制了卵泡膜細胞睪酮的分泌。 結(jié)論：(1)本文在成功克隆人NR4A1基因的基礎上，構(gòu)建NR4A1重組腺病毒載體。人NR4A1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建為進一步研究NR4A1在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制奠定了基礎。(2)建立起小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)模型，該模型為進一步研究與PCOS發(fā)病相關的差異基因、蛋白的功能及其作用機制提供了良好的平臺。(3)NR4A1基因在小鼠卵泡膜細胞內(nèi)超表達后明顯地抑制了卵泡膜細