重組人抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位sIgA分子的構(gòu)建表達(dá)及特性研究.pdf

1、幽門(mén)螺桿菌(Helicobactet pylori,Hp)為一種革蘭陰性細(xì)菌，是人類慢性活動(dòng)性胃炎和消化潰瘍的重要原因，被確認(rèn)是胃癌和胃淋巴樣組織淋巴瘤的危險(xiǎn)因子。Hp感染與社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況密切相關(guān)，在許多發(fā)展中國(guó)家其感染率超過(guò)50％，在發(fā)達(dá)國(guó)家達(dá)40％。Hp感染后若不采取特殊治療措施常常為終身帶菌。由于胃內(nèi)的高酸性對(duì)抗生素有較大影響，所以，這些抗生素往往要與質(zhì)子泵抑制劑和雷尼替丁枸櫞酸鉍同時(shí)使用。雖然組合抗生素方法對(duì)于治療Hp感染是有效的

2、，但是研制一種有效的疫苗將會(huì)更有益處，特別是在胃癌發(fā)病率高、感染復(fù)發(fā)率大和抗生素耐藥性不斷增高的國(guó)家。實(shí)驗(yàn)證明疫苗療法對(duì)于Hp感染動(dòng)物模型是相當(dāng)成功的，然而在此基礎(chǔ)上研制一種人類預(yù)防或治療性疫苗仍然是非常困難的。采用眾多候選疫苗進(jìn)行的大量臨床試驗(yàn)表明其效力較差。人類在通過(guò)口服抗體治療和預(yù)防Hp方面也進(jìn)行了許多嘗試，實(shí)驗(yàn)證明口服抗尿素酶IgA單克隆抗體可保護(hù)小鼠不受貓胃螺桿菌(Helicobacter felis)感染。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)sIg

3、A在兒童期防止消化道Hp感染中起著重要的作用，母乳中的IgA被攝入后能在消化道粘膜表面清除外來(lái)微生物或隨食物吞咽下的抗原。Tharas在岡比亞的研究發(fā)現(xiàn)，生后第一年未感染幽門(mén)螺桿菌的嬰兒的母乳其特異性sIgA滴度較感染嬰兒的母乳中高2～4倍，表明了母乳通過(guò)抗體依賴機(jī)制在防止幽門(mén)螺桿菌感染上起重要作用，尤其是Hp感染的母親其高濃度的特異性sIgA能大大延遲嬰兒的幽門(mén)螺桿菌感染，而第二年以后的感染可能與母嬰的密切接觸以及斷乳有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)

4、明特異性抗Hp sIgA在預(yù)防和治療Hp感染方面具有重要作用。然而，單克隆抗體為鼠源且不能大規(guī)模生產(chǎn)，而從母乳中提取足量的slgA分子也不現(xiàn)實(shí)。所以，有必要通過(guò)抗體工程技術(shù)獲得大量特異性針對(duì)Hp的sIgA分子。1994年，Michette et al.首次利用純化的Hp尿素酶作為抗原免疫小鼠，顯示對(duì)貓螺桿菌(Hf)感染有良好的保護(hù)作用，分別口服Hp尿素酶(全部結(jié)構(gòu))或其A亞單位、B亞單位，再加上霍亂毒素(CT)作為佐劑，結(jié)果證明了起保護(hù)

5、作用的是B亞單位(UreB)。另有許多實(shí)驗(yàn)證明，Hp UreB能夠作為口服疫苗用于預(yù)防和治療Hp感染。所以，我們決定構(gòu)建抗Hp UreB sIgA分子。主要研究結(jié)果如下： 1．抗Hp噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建和篩選 首先檢測(cè)獻(xiàn)血員抗Hp和rUreB抗體，分離陽(yáng)性者外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA并等量混合。利用RT-PCR擴(kuò)增全套重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，分子量分別約為400bp和350bp。將VH和VL純化后

6、采用overlap方法連接，插入噬菌體載體pComb3x構(gòu)建成庫(kù)容量為4.6×10<'8>的單鏈抗體噬菌體庫(kù)。以純化rUreB為靶標(biāo)包被96孔板，用3％BSA封閉液封閉，加入噬菌體孵育后，用洗脫液沖洗5次進(jìn)行篩選。之后的篩選逐漸降低rUreB包被濃度，并增加沖洗次數(shù)。在5輪篩選之后，獲得與rUreB發(fā)生反應(yīng)的41個(gè)克隆，最強(qiáng)的克隆命名為scFv1，通過(guò)免疫印跡的方法證明，scFv1僅與rUreB和Hp菌株反應(yīng)，不與非Hp菌株反應(yīng)，因此，

7、將scFv1送出測(cè)序。 2．表達(dá)載體pcDNA3.1(+)：HSVHCα<,1>和pcDNA3.1(+)：LSVLCλ<,2>的構(gòu)建 首先分離人外周血中性粒細(xì)胞并提取RNA，采用RT-PCR的方法獲得人IgA1重鏈恒定區(qū)(Cα<,1>)基因，該片段分別含有EcoRI和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。重鏈信號(hào)肽編碼序列是通過(guò)引物之間重疊延伸的方法獲得的。該序列與VH片段的連接采用overlap的方法，連接物含有HindⅢ和EcoRI酶切

8、位點(diǎn)。表達(dá)載體pcDNA3.1(+)：HSVHCα1是通過(guò)三個(gè)部分連接而成：(i)經(jīng)HindⅢ/XbaⅠ酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，(ii)經(jīng)HindⅢ/EcoRI處理的重鏈信號(hào)肽編碼序列與VH片段的連接物，(iii)經(jīng)EcoRI/XbaⅠ消化的Cal基因。輕鏈恒定區(qū)(CX2)編碼序列是從人脾細(xì)胞基因組DNA通過(guò)PCR獲得的，該片段含有EcoRI和NotⅠ酶切位點(diǎn)。輕鏈信號(hào)肽編碼序列的獲得采用與重鏈信號(hào)肽相同的方法。該序列與VL片

9、段的連接同樣采用overlap的方法，連接物引入HindⅢ和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。表達(dá)載體pcDNA3.1(+)：LSVLCλ2同樣由三部分裝配而成：(i)經(jīng)HindⅢ/NotⅠ酶切的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，(ii)經(jīng)HindⅢ/EcoRI處理的輕鏈信號(hào)肽編碼序列與VL片段的連接物，(iii)經(jīng)EcoRI/NotⅠ消化的Cλ2基因。 3．表達(dá)載體pcDNA3.1(+)Hyg：J Chain和pcDNA3.1(-)Bsd：S

10、C的構(gòu)建 首先用SmaⅠ和Bpul4Ⅰ處理質(zhì)粒pcDNA3.1(+)以切除neoR抗性基因。hygR抗性基因是以質(zhì)粒pMEP4(Invitrogen)為模板通過(guò)PCR的方法獲得的，分子量大約為1.1kb，并且含有SmaⅠ和Bpul4Ⅰ酶切位點(diǎn)。用SmaⅠ和Bpul4Ⅰ酶切PCR產(chǎn)物后，與切除neoR抗性基因的pcDNA3.1(+)連接產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1(+)Hyg。人J鏈編碼序列是以人脾細(xì)胞RNA為模板通過(guò)RT-PCR獲得

11、的，分子量大約為430bp，含有HindⅢ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。用HindⅢ和NotⅠ處理RT-PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)Hyg后，將二者相連形成表達(dá)載體pcDNA3.1(+)Hyg：Jchain。分泌片(Secretory component，SC)的編碼序列是采用RT-PCR方法從人結(jié)腸腺癌HT29細(xì)胞中獲得的，含有HindⅢ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。用HindⅢ和XbaⅠ處理RT-PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1(-)Bsd，

12、然后將二者相連形成表達(dá)載體pcDNA3.1(-)Bsd：SC。 4．穩(wěn)定表達(dá)特異性針對(duì)Hp UreB sIgA的CHO細(xì)胞的篩選 首先用含有小牛血清、Hepes(pH 7.0)、青霉素和鏈霉素的IMDM培養(yǎng)CHO細(xì)胞。對(duì)1×10<'7>CHO細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，用ScaⅠ-線性化的pcDNA3.1(+)：HSVHCα1和BglⅡ-線性化的pcDNA3.1(+)：LSVLCλ2轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。24 h后用500 μg/ml

13、 G418開(kāi)始篩選，連續(xù)進(jìn)行3周。挑取單克隆于96孔板，dot-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清。對(duì)表達(dá)最大量IgA1的克隆(Clonel)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用BglⅡ-線性化的pcDNA3.1(+)Hyg：Jchain進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。在500μg/ml G418和400μg/ml潮霉素同時(shí)存在的條件下篩選，從而獲得了表達(dá)最大量dlgA的克隆(Clone 2)。對(duì)1×10<'7>CHO細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，然后用Bglμ-線性化的pcDNA3.1(-)B

14、sd：SC進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后用10μg/ml殺稻瘟菌素開(kāi)始篩選，連續(xù)進(jìn)行3周。挑取單克隆于96孔板，dot-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲得表達(dá)最大量dIgA的克隆(Clone 3)。將Clone 2和Clone 3細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮，37℃作用2h。這樣，通過(guò)dIgA和SC結(jié)合我們得到sIgA分子。sIgA的特異性通過(guò)免疫印跡的方法證明，sIgA僅與rUreB和Hp菌株反應(yīng)，不與非Hp菌株反應(yīng)。另外Hp菌株與sIgA作用后，其粘附胃