中藥火把花根治療腎小球腎炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性腎小球腎炎(chronicglomerulonephritis，GN)是由多種病因，多種病理類型組成的腎小球疾病，在我國仍是導(dǎo)致慢性腎衰最常見病因之一。系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)是我國原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型，據(jù)統(tǒng)計(jì)約占我國腎穿刺病人的50％左右。目前在臨床上尚無特效治療，大多數(shù)患者最終發(fā)展至終末期腎病。尋找有效的治療方法，減少蛋白尿，防治腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展，延緩腎功能進(jìn)展，在臨床上具有非常重要意義。 腎

2、硬化的發(fā)展過程是；正常的腎小球被堆積的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)替代，最終導(dǎo)致腎小球纖維化。目前的實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)腎小球的三種細(xì)胞(系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞即足細(xì)胞)均參與了腎硬化的發(fā)生。國內(nèi)外學(xué)者對引起系膜ECM堆積的因素進(jìn)行了大量的研究，表明許多細(xì)胞因子在其中起重要作用，這些因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)，血小板源生長因子(PDGF)，結(jié)締組織生長因子(CT

3、GF)等。 PDGF在腎臟疾病，特別是炎癥和增生性腎臟疾病發(fā)病中起著重要作用，它與增殖性腎炎時(shí)系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積等過程密切相關(guān)。目前的體外及動物實(shí)驗(yàn)研究表明抑制PDGF可能減少ECM的積聚和減輕腎小球硬化的病理改變。這為系膜增殖性腎炎的治療提供了一條新的途徑。 在諸多與腎纖維化的發(fā)展有關(guān)的細(xì)胞因子中，TGF-β起中心調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí)在抗-Thy1模型腎炎中，TGF-β起重要作用，是

4、主要的致纖維化細(xì)胞因子。Smads家族是近年發(fā)現(xiàn)的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一組重要的傳遞分子，Smad3為通路限制性分子之一，當(dāng)其與Smad2一起被TGF-β1的Ⅰ型受體磷酸化后，可與Smad4形成異源性多聚體，并轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結(jié)合，激活DNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)。 火把花根是衛(wèi)茅科雷公藤屬植物昆明山海棠，以去皮之根心入藥，產(chǎn)于四川省西昌、德昌、涼山等地，是由重慶市中藥研究院精心研制的純中藥制劑。目前，國內(nèi)有多家報(bào)1道應(yīng)用中

5、藥火把花根治療腎小球腎炎，我們在臨床上也用此藥治療慢性腎炎患者，部分病人取得了較好的減少蛋白尿的效果。但其對腎臟病理改變及腎硬化發(fā)展的影響，以及其作用機(jī)制仍不明確。因此，本課題一方面觀察火把花根對MsPGN大鼠蛋白尿、腎臟組織病理改變、ECM成分纖維連接蛋白(FN)沉積、足細(xì)胞超微病理變化的影響，另一方面觀察纖維化細(xì)胞因子PDGF、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)變化，及TGF-β信號分子Smad3mRNA表達(dá)，探討火把化根治療MsPGN

6、的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 第一部分:中藥火把花根對實(shí)驗(yàn)性腎炎病理改變的影響 目的：通過動物實(shí)驗(yàn)觀察中藥火把花根治療大鼠抗Thy1系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)模型的有效性，并與激素治療進(jìn)行比較。 方法：應(yīng)用兔抗大鼠胸腺細(xì)胞免疫血清(anti-thymocyteserum,ATS)復(fù)制大鼠MsPGN模型即抗-Thy1.1模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對照組、模型組、模型+火把花根治療組(模型組)、模型+激素

7、治療組(激素組)、模型+火把花根合激素治療組(聯(lián)合治療組)，分別于用藥治療第1、2、4周末留血、尿檢查肝功能、腎功能、尿蛋白定量，同時(shí)每組隨機(jī)處死5只大鼠，取腎組織一部分進(jìn)行腎臟病理檢查及用免疫組織化學(xué)方法測定腎小球系膜基質(zhì)成分——纖維連接蛋白(FN)沉積，采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，另一部分送超微病理檢查，觀察足細(xì)胞及系膜區(qū)改變。并取肝臟進(jìn)行病理檢查，觀察藥物對肝臟影響。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)第1周

8、末模型組尿蛋白明顯增多達(dá)866.33±78.05mg/24h，以后逐漸下降，但第4周末仍處于高水平(355.75±50.63mg/24h)，與正常對照組(144.00±27.18mg/24h)比較仍有極顯著性差異(p＜0.01)。在實(shí)驗(yàn)1、2、4周末，治療組(火把花根組、激素組、聯(lián)合治療組)尿蛋白定量明顯降低，雖仍顯著高于正常對照組，但與模型組比較顯著下降，差異極顯著(p＜0.01)，激素治療組在第4周與對照組無差異，三組減少蛋白尿效果

9、無顯著性差異(p＞0.05)。各組血尿素氮、肌酐、血轉(zhuǎn)氨酶(谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶)水平均無顯著增高。肝臟病理學(xué)檢查亦未發(fā)現(xiàn)明顯異常。腎臟病理學(xué)檢查見模型組動物腎小球系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，計(jì)算機(jī)圖文分析結(jié)果表明系膜基質(zhì)的面積與整個(gè)2腎小球的面積的比值(ECM/CA比值)顯著增高，三個(gè)治療組系膜增生明顯減輕，ECM/CA比值顯著低于對照組，差異有極顯著意義(p＜0.01)，以含有火把花根的兩組(火把花根治療組及聯(lián)合治療組)更顯著，與單用

10、激素組比較有顯著差異(p＜0.01)。免疫組織化學(xué)染色表明，模型組腎小球系膜基質(zhì)成分FN蛋白表達(dá)明顯增高，三個(gè)治療組FN蛋白表達(dá)均較模型組顯著下降(p＜0.01)，其減輕的程度也是以含有火把花根的兩組更明顯，與單用激素組比較有極顯著性差異。超微病理檢查見模型組部分足細(xì)胞腫脹，大部分節(jié)段足突彌漫性融合，系膜基質(zhì)輕度少數(shù)階段中度增生，治療組足細(xì)胞無明顯腫脹，大部分節(jié)段足突排列整齊，少數(shù)節(jié)段足突部分融合，其中聯(lián)合治療組與正常對照組接近，無明顯

11、足突融合，火把花根組足突融合較激素組輕。治療組系膜基質(zhì)無明顯增生。 結(jié)論：火把花根治療可使試驗(yàn)性腎炎大鼠蛋白尿減少，并減輕系膜增生及系膜基質(zhì)成分FN蛋白表達(dá)，其減少蛋白尿的效果與激素相當(dāng)，但減輕系膜增生及ECM堆積的作用優(yōu)于單用激素組。且火把花根可減輕足細(xì)胞損害，其作用優(yōu)于單用激素組，但聯(lián)合治療組效果更加，提示兩種藥物具有協(xié)同作用。 第二部分:中藥火把花根對實(shí)驗(yàn)性腎炎大鼠腎組織纖維化細(xì)胞因子表達(dá)的影響 目的：通過

12、動物實(shí)驗(yàn)觀察中藥火把花根對大鼠抗Thy1.1系膜增生性腎小球腎炎模型腎皮質(zhì)纖維化細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探討火把花根治療腎小球腎炎的作用機(jī)制。 方法：應(yīng)用兔抗大鼠胸腺細(xì)胞免疫血清(anti-thymocyteserum,ATS)復(fù)制大鼠MsPGN模型即抗-Thy1.1模型，將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對照組、模型組、模型+火把花根治療組(模型組)、模型+激素治療組(激素組)、模型+火把花根合激素治療組(聯(lián)合治療組)，分別于用藥治療第1、2、4周末

13、每組隨機(jī)處死5只大鼠，取腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法定細(xì)胞因子PDGF及TGF-β1蛋白表達(dá)，采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。用RT-PCR方法測定PDGF、TGF-β1、TGF-β1信號分子Smad3mRNA表達(dá)。 結(jié)果：正常組腎小球極少PDGF及TGF-β1沉積，模型組腎小球PDGF及TGF-β1沉積顯著增多，計(jì)算機(jī)分析結(jié)果表明模型組蛋白表達(dá)顯著高于對照組，治療組兩種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)顯著低于對

14、照組(p＜0.01)，以聯(lián)合治療組下降最顯著，激素組次之，且兩組與單用激素組比較有顯著性差異(p＜0.01)。RT-PCR測定PDGF及TGF-β1mRNA以及TGF-β信號分子Smad3mRNA結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果一致，模型組較正常組上述指標(biāo)均顯著增高，治療組較模型組顯著下降，以聯(lián)合治療組最明顯，火把花根組次之，兩組與單用激素組比較有顯著差異(p＜0.01)。 結(jié)論：火把花根可能通過抑制纖維化細(xì)胞因子PDGF及TGF-β1表達(dá)，