過表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2基因預(yù)防低氧性肺動(dòng)脈高壓的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 低氧性肺動(dòng)脈高壓是呼吸系統(tǒng)的常見病，目前缺乏理想的治療手段，患者預(yù)后差。低氧性肺血管收縮和肺血管重塑是低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)主要環(huán)節(jié)。肺血管重塑在低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制中起了十分重要的作用，是目前研究的熱點(diǎn)，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移所致的肺小動(dòng)脈壁中層增厚及遠(yuǎn)端無肌細(xì)動(dòng)脈的肌化。低氧通過上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的表達(dá)，發(fā)揮誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移的作用，從而促

2、進(jìn)肺血管重塑的發(fā)生。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)ACE的同工酶。ACE和ACE2是存在于RAS系統(tǒng)中的相互對立的一對核心樞紐，他們共同調(diào)控許多疾病。ACE2通過促進(jìn)Ang-(1-7)的產(chǎn)生，降解AngⅡ，而發(fā)揮拮抗ACE的作用，局部組織的ACE和ACE2比例失衡可導(dǎo)致多種疾病。且在這些疾病當(dāng)中往往存在ACE的表達(dá)上調(diào)，而ACE2的表達(dá)相對不足，若通過各種方式上調(diào)ACE2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。研究顯示長時(shí)間的低氧可導(dǎo)致A

3、CE和ACE2之間的比例失衡，且ACE2能抑制低氧所誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移作用，表現(xiàn)出與ACE相拮抗的作用，這提示ACE2可能具有抑制血管重塑發(fā)生的作用。
　　 基于以上分析，我們推測局部表達(dá)ACE2能有效的抑制肺血管重塑，具有治療低氧性肺動(dòng)脈高壓的潛力。本研究以慢病毒為載體，局部表達(dá)ACE2，觀察其抑制肺血管重塑及緩解肺動(dòng)脈高壓的作用，以期為低氧性肺動(dòng)脈高壓的臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法

4、：
　　 將大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間段低氧干預(yù)(0h，6h，12h，24h，48h)，用RT-PCR及Westernblot方法觀察PASMCs的ACE、ACE2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及兩者的比例有否失衡；建立低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，比較常氧對照組和低氧干預(yù)組大鼠肺組織的ACE、ACE2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及兩者的比例有否失衡。構(gòu)建過表達(dá)ACE2基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)，分

5、別用CCK-8法、Transwell小室法比較ACE2轉(zhuǎn)染組與對照病毒轉(zhuǎn)染組PASMCs的增殖、遷移能力；將過表達(dá)ACE2基因的慢病毒液經(jīng)氣道內(nèi)滴注的方式感染SD大鼠，同時(shí)設(shè)立對照病毒感染組及常氧對照組。2周后將大鼠分別常氧、低氧下飼養(yǎng)，4周后通過檢測各組右心室收縮壓(RVSP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)、顯微鏡下肺血管重塑指標(biāo)，觀察其抑制肺血管重塑及緩解肺動(dòng)脈高壓的作用。
　　 結(jié)果：
　　 (1)大鼠原代PASMC

6、s的ACEmRNA和蛋白表達(dá)量隨低氧培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸升高，一直持續(xù)至48h(P<0.01)；ACE2mRNA和蛋白表達(dá)量分別在低氧培養(yǎng)12h、24h時(shí)達(dá)到高峰(P<0.05)，隨后下降。ACE和ACE2mRNA、蛋白表達(dá)的比值在低氧培養(yǎng)48h前各時(shí)間段無顯著差異，而48h時(shí)出現(xiàn)兩者比例明顯升高(P<0.05)。
　　 (2)低氧組與常氧組相比，其肺組織ACEmRNA表達(dá)升高，有顯著差異(P<0.01)；ACE2mRNA兩組間無

7、顯著差異；ACEmRNA與ACE2mRNA比值升高(P<0.05)。ACE的蛋白表達(dá)兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ACE2的蛋白表達(dá)，低氧干預(yù)組明顯低于常氧對照組(P<0.05)；ACE/ACE2的比值低氧干預(yù)組明顯高于常氧對照組(P<0.05)。
　　 (3)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示無論常氧和低氧條件下，轉(zhuǎn)染ACE2基因的PASMCs細(xì)胞增殖能力較對照病毒轉(zhuǎn)染組明顯下降(P<0.05)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移能力較對照

8、組顯著下降(P<0.01)。
　　 (4)低氧+ACE2轉(zhuǎn)染組大鼠的RVSP較低氧+對照病毒轉(zhuǎn)染組明顯降低[(36.45±0.64)mmHgVS(41.21±1.26)mmHg，P<0.05]，RVHI亦明顯降低(0.24±0.01VS0.32±0.03，P<0.05)；低氧+ACE2轉(zhuǎn)染組與低氧+對照病毒組相比血管重塑指標(biāo)WT％明顯降低[(25.68±2.07)％VS(41.58±2.81)％，P<0.01]；WA％亦明顯降低

9、[(32.22±3.24)％VS(44.08±4.96)％，P<0.05]。
　　 結(jié)論：
　　 本研究結(jié)果表明：(1)低氧可誘導(dǎo)大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ACE/ACE2表達(dá)的失衡，而低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺組織中ACE/ACE2表達(dá)亦失衡，提示ACE2與低氧性肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的形成有關(guān)。(2)轉(zhuǎn)染過表達(dá)ACE2基因后離體PASMCs的增殖和遷移能力明顯抑制。以慢病毒為載體，通過氣道內(nèi)滴注的轉(zhuǎn)染途徑將過表達(dá)AC