雛鴨感染DRV后炎性相關(guān)因子與脾損傷之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系.pdf

1、鴨呼腸孤病毒病是由鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus，DRV)引起的以脾表面出現(xiàn)黃白色壞死灶，法氏囊萎縮為主要特征的一種急性傳染病，該病毒可感染雛鴨和雞，繼發(fā)感染其他病原引起動(dòng)物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于哺乳動(dòng)物脾損傷的機(jī)制研究已逐步深入，研究結(jié)果表明PKR在各種損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但是關(guān)于鴨PKR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還未見報(bào)道，且是否參與DRV引起脾損傷的進(jìn)程還不清楚。因此研究PKR在脾損傷中的作用是很有必要的。

2、本研究通過(guò)建立人工感染模型，探討PKR介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路在DRV感染雛鴨致脾損傷中的作用。主要包括以下幾個(gè)方面:
　　1.DuTNF-α多克隆抗體的制備
　　本實(shí)驗(yàn)以雛鴨脾組織的RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增DuTNF-α基因，克隆至pET-28a載體上，經(jīng)過(guò)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定測(cè)序分析正確后，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-DuTNF-α，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中，在IPTG終濃度1mmol/L和37

3、℃條件下誘導(dǎo)4h，外源基因獲得高效表達(dá)。通過(guò)Ni柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化，純化后的DuTNF-α蛋白免疫新西蘭大耳白兔，經(jīng)三次免疫后取全血，分離得到DuTNF-α多克隆抗體。利用Elisa和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果表明多克隆抗體有較好的反應(yīng)原性。
　　2.建立DRV感染7日齡櫻桃谷鴨模型
　　分別在雛鴨感染后1d、3d、5d、7d、14d剖殺取脾組織。從組織形態(tài)學(xué)判定脾損傷程度，采用組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)判定炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。利用R

4、T-qPCR技術(shù)檢測(cè)感染后脾中PKR、MKK6、AP-1、IPS-1、NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，并分別取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的脾臟石蠟切片，每組各取三個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行免疫組化，使用數(shù)字切片掃描儀將切片掃描，使用單位面積陽(yáng)性率進(jìn)行結(jié)果分析。
　　眼觀病變發(fā)現(xiàn)，感染后1d、3d脾顯著腫大，顏色逐漸加深，部分病灶呈暗黑色，感染5d后脾顏色恢復(fù)正常，脾表明可見明顯大小不一的黃白色病灶。組織病理學(xué)觀察結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)感染后3d脾出血嚴(yán)重，白髓淋巴細(xì)胞明顯減少，感染后5d脾臟可見明顯的壞死灶，壞死灶與周圍健康細(xì)胞分界明顯，感染7d后可見明顯的肉芽腫結(jié)構(gòu)。根據(jù)Opriessning T的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)脾組織學(xué)病理?yè)p傷進(jìn)行評(píng)定發(fā)現(xiàn)感染3d后出血嚴(yán)重，感染5d后發(fā)生壞死，感染7d后形成肉芽腫結(jié)構(gòu)。用DRV特異性抗體及炎癥細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，證明脾產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。熒光定量檢測(cè)脾中PKR介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)量，結(jié)果顯示PKR在感染

6、后1d、3d、5d處于上調(diào)表達(dá)，且5d達(dá)到峰值，7d、14d與5d試驗(yàn)組相比差異顯著(P＜0.05)，這與病毒的表達(dá)量呈正相關(guān)，說(shuō)明PKR可能參與dsRNA的識(shí)別，從而激活下游因子引起脾臟損傷。MKK6、AP-1、IPS-1在感染過(guò)程中均無(wú)上調(diào)表達(dá)，而NF-κB在整個(gè)感染過(guò)程中一直處于上調(diào)表達(dá)。可見在DRV感染雛鴨后PKR參與病毒的識(shí)別，并激活NF-κB入核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子。下游炎癥因子TNF-α表達(dá)趨勢(shì)與NF-κB一致，IL-6在感染