腫瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下，給我國造成了巨大的經濟損失。其防治的關鍵是早發(fā)現早治療，而我國胃癌的早診率較低，致使病人確診時已是中晚期，延誤了手術時機。分子影像的出現為胃癌的診治提供了新的思路，其關鍵是找到一個具有靶向特異性的分子。腫瘤血管靶向多肽的研究應用是目前國際公認的有效方法，利用噬菌體肽庫篩選出腫瘤血管靶向肽有些已經進入臨床試驗階段，具有良好的應用價值。
　　我課題組一直致力于胃癌血管生

2、成的研究，并在前期篩選出了腫瘤血管靶向性多肽GX1，研究顯示其可以特異性地與腫瘤血管內皮細胞結合，并在體內具有一定的腫瘤靶向作用。利用GX1我們制備了一系列探針或藥物，在胃癌的診斷和治療方面做了大量研究，顯示出了GX1的應用前景。但是GX1的親和力及靶向性仍不足，我們又對其進行了修飾，以期彌補這些不足。本文即是將GX1制成二聚體，利用多種方法鑒定其體內外的特征，為胃癌的診治提供一條新的思路。
　　目的：
　　1)合成GX1的

3、二聚體，鑒定其是否親和力及靶向性優(yōu)于單體；
　　2)摸索188Re的標記方法，制備188Re-PEG-(GX1)2，將其用于胃癌的SPECT成像，研究其用于胃癌診斷及治療的可行性；
　　3)摸索68Ga的標記方法，制備68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2，將其用于胃癌的PET成像，研究其用于胃癌診斷的可行性；
　　方法：
　　1)制備188Re-PEG-(GX1)2并做質量鑒定，測定標記率和穩(wěn)定性；體外細胞結

4、合分析及競爭性抑制實驗驗證188Re-PEG-(GX1)2與Co-HUVECs結合的特異性，判斷GX1二聚體的親和力是夠增加；MTT分析及流式細胞術驗證188Re-PEG-(GX1)2抑制Co-HUVECs增殖、誘導細胞凋亡的作用；
　　2)荷瘤裸鼠的SPECT成像及T/H定量驗證188Re-PEG-(GX1)2的在體靶向性；BLI監(jiān)測荷瘤裸鼠的腫瘤生長，判斷188Re-PEG-(GX1)2的治療效果；
　　3)離體腫瘤組織

5、的CD31染色、Ki67染色、TUNEL等驗證188Re-PEG-(GX1)2抑制腫瘤血管生成、抑制細胞增殖及誘導凋亡作用；對肝、腎的HE染色及生化分析判斷188Re-PEG-(GX1)2對肝、腎功能的影響。
　　4)制備68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2并做質量鑒定，測定標記率和穩(wěn)定性；體外細胞結合分析及競爭性抑制實驗驗證68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs結合的特異性；細胞免疫熒光和攝取及外排實驗

6、判斷GX1二聚體的親和力是夠增加；
　　5) Nano PET/CT成像、SUV值定量、生物學分布等實驗驗證68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2在荷瘤裸鼠體內的腫瘤靶向性，定量分析其在體分布。結果：
　　1)成功制備了188Re-PEG-(GX1)2，標記率大于96％，在血清中72 h穩(wěn)定存在；體外細胞結合分析及競爭性抑制實驗結果表明188Re-PEG-(GX1)2能夠與Co-HUVECs特異性結合，且親和力高于188R

7、e-GX1和188Re-URP；MTT分析和流式細胞術結果證實188Re-PEG-(GX1)2在體外可有效抑制Co-HUVECs增殖、誘導Co-HUVECs凋亡，作用效果優(yōu)于188Re-GX1和188Re-URP；
　　2) SPECT成像結果證實188Re-PEG-(GX1)2在荷瘤裸鼠體內具有良好的胃癌靶向性，T/H比值高于188Re-GX1；BLI監(jiān)測荷瘤裸鼠治療過程中的腫瘤變化，結果發(fā)現188Re-PEG-(GX1)2在體

8、內具有抑制腫瘤增殖的效果，且效果優(yōu)于188Re-GX1；
　　3)對離體腫瘤組織的CD31、Ki67、TUNEL染色，結果表明與188Re-GX1相比，188Re-PEG-(GX1)2在體內更能抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡；HE染色及生化分析結果表明探針在體內未對肝腎形態(tài)及功能造成可見的影響；
　　4)成功制備了68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2，標記率大于97%，在血清中90 min穩(wěn)定存在

9、；體外細胞受體結合分析及競爭性抑制實驗結果表明，68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結合高于HUVEC、BGC823和GES等細胞，說明該探針特異性地與腫瘤血管內皮細胞結合；同時該實驗結果也表明68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結合高于68Ga-DOTA-GX1，說明二聚體確實提高了GX1的親和力；細胞免疫熒光證實，KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結合明顯高于單體GX1；細

10、胞的攝取和外排實驗證明，Co-HUVECs攝取68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2高于68Ga-DOTA-GX1，并且在60 min時達到最大；
　　5) Nano PET/CT成像結果顯示，注射68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2的裸鼠腫瘤顯像清晰，腫瘤部位的SUV值明顯高于注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠，說明探針的體內靶向性較好；最后我們用生物學分布定量地觀察探針在荷瘤裸鼠體內的分布，結果顯示當腎臟和肝臟等器官快

11、速代謝的時候，注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠腫瘤部位放射性有相對緩慢的下降；同時，在60 min時除了肝腎以外，腫瘤部位的%ID/g超過其他正常器官，結果說明腫瘤對探針有較好的吸收。
　　結論：
　　1)對GX1的修飾成功，GX1二聚體的體內外屬性明顯優(yōu)于單體；
　　2)成功制備了既能用于胃癌診斷也能用于胃癌治療的診療一體化探針188Re-PEG-(GX1)2，具有胃癌診療的應用前景；
　　3)成功制備了胃