腫瘤血管靶向肽GX1的PEG修飾及其在胃腸道腫瘤的分子影像研究.pdf

1、背景：
　　胃腸道腫瘤呈世界高發(fā)的流行趨勢，傳統(tǒng)治療方法在提高治愈率方面療效甚微，醫(yī)學(xué)研究者不斷地探索新的治療方法，以期攻克腫瘤，尤其是惡性胃腸道腫瘤。1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長依賴血管生成的理論，這為腫瘤的抗血管生成治療開辟了道路。此后，圍繞這一領(lǐng)域展開了大量廣泛且深入的研究，但缺少能與腫瘤血管特異性結(jié)合且體內(nèi)具有靶向到腫瘤血管的異質(zhì)性分子是這一治療手段前進(jìn)的瓶頸。
　　實(shí)驗(yàn)室一直致力于該領(lǐng)域研究，積極尋找腫

2、瘤血管特異的靶向性分子，并于2004年利用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)在荷人胃癌裸鼠模型經(jīng)過體內(nèi)4輪淘篩，篩選出環(huán)狀九肽GX1。前期研究顯示，GX1可與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，具有良好的體內(nèi)靶向性。但其與受體親和力和體內(nèi)的藥代動力學(xué)還有待改善。文獻(xiàn)報(bào)道，PEG修飾可以改善多肽類藥物的生物學(xué)活性，具有諸多優(yōu)點(diǎn)。故實(shí)驗(yàn)室利用叉形mPEG5000制備GX1的二聚體和四聚體，以期能彌補(bǔ)GX1的不足之處。
　　目的：
　　1.用PEG修飾G

3、X1，制備GX1的多聚體，篩選出最佳的修飾肽。
　　2.對篩選出來的修飾肽進(jìn)行體內(nèi)外鑒定，評價(jià)其是否優(yōu)于GX1。
　　方法：
　　1.利用叉形PEG交聯(lián)的方法，得到PEG化GX1二聚體[ PEG-(GX1)2]和四聚體[ PEG-(GX1)4]，放射性同位素99mTc標(biāo)記后利用SPECT顯像篩選出擁有最佳腫瘤血管靶向性的短肽。
　　2.制備生物素化的PEG-(GX1)2，細(xì)胞免疫熒光觀察其在共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及

4、定位，通過不同細(xì)胞的熒光強(qiáng)度評價(jià)其對細(xì)胞的特異性；99mTc直接標(biāo)記法標(biāo)記 PEG-(GX1)2，利用體外受體放射配基結(jié)合分析及競爭性抑制實(shí)驗(yàn)和受體飽和分析來評價(jià)其與受體的親和力及對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性；裸鼠皮下接種SGC7901或LoVo細(xì)胞，尾靜脈注射標(biāo)記肽，利用SPECT觀察腫瘤位置在0.5 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h等時(shí)間點(diǎn)的顯像，并用計(jì)算機(jī)勾畫感興趣區(qū)（ROI），計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤與心臟放射性的比值

5、，以此來觀察標(biāo)記肽在體內(nèi)的靶向性。
　　3.利用生物學(xué)分布定量計(jì)算標(biāo)記肽在體內(nèi)的分布，評價(jià)其在體內(nèi)是否具有腫瘤靶向作用。
　　結(jié)果：
　　1.使用叉形 mPEG5000交聯(lián)的方法，成功制備了PEG-(GX1)2和PEG-(GX1)4。放射性同位素99mTc標(biāo)記，然后利用SPECT顯像篩選出了擁有最佳腫瘤血管靶向性的短肽PEG-(GX1)2。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合

6、高于 GX1與Co-HUVEC的結(jié)合，也高于 PEG-(GX1)2與 HUVEC的結(jié)合，而PEG-(GX1)2與SGC7901、LoVo、GES和HIEC細(xì)胞不結(jié)合，URP與Co-HUVEC也不結(jié)合。同時(shí)，共聚焦顯微鏡還觀察到PEG-(GX1)2表達(dá)于Co-HUVEC的胞漿，核周表達(dá)最高。體外受體放射配基結(jié)合分析及競爭性抑制實(shí)驗(yàn)顯示，99mTc-PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合高于HUVEC，也高于99mTc-GX1與Co

7、-HUVEC的結(jié)合，并可被GX1競爭性抑制，但與腫瘤細(xì)胞或正常粘膜上皮細(xì)胞不結(jié)合。受體飽和分析顯示99mTc-PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合高于 HUVEC，兩條曲線均呈飽和曲線，說明 PEG-(GX1)2與兩種細(xì)胞結(jié)合屬于受體特異性結(jié)合。SPECT顯像結(jié)果可以看出，腫瘤組織對99mTc-PEG-(GX1)2的吸收明顯高于99mTc-GX1，并且延長了腫瘤的滯留率，腎的吸收減弱，體內(nèi)藥代動力學(xué)得到改善，而對99mTc-U

8、RP無吸收；并且注射99mTc-PEG-(GX1)2的瘤心比大于注射99mTc-GX1的，說明隨著血液中放射性的逐漸清除，腫瘤中的放射性有聚集的趨勢。
　　3.生物學(xué)分布進(jìn)一步證實(shí)了SPECT顯像的結(jié)果。以上結(jié)果均說明PEG-(GX1)2的親和力、特異性及靶向性均優(yōu)于GX1。
　　結(jié)論：
　　PEG修飾的GX1二聚體可以明顯提高短肽的特異性、結(jié)合力和靶向性，體內(nèi)藥代動力學(xué)明顯改善。99mTc-PEG-(GX1)2是一個(gè)