131I標(biāo)記酪氨酸(Tyr)修飾的腫瘤血管靶向肽GX1用于分子影像及體外放射治療研究.pdf

1、【背景】
　　胃腸道腫瘤是危害人類健康的最常見惡性腫瘤,多數(shù)患者就診時(shí)病情多已處于進(jìn)展期或晚期,因缺乏其他有效的治療方式,以往對其的治愈率一直很低,醫(yī)學(xué)科學(xué)者也在積極不斷的探索和嘗試新的有效治療腫瘤的方法。1971年,Folkman教授提出的“腫瘤生長依靠新生血管生成的學(xué)說”[1-2]開創(chuàng)了腫瘤治療的新領(lǐng)域,隨后,圍繞腫瘤新生血管抑制療法研制和篩選出了許多抗體和多肽,但一直缺乏一種特別有效的靶向分子或短肽同時(shí)用于腫瘤的診斷和治療。

2、
　　近年來隨著分子影像研究技術(shù)的發(fā)展,放射性核素標(biāo)記小分子多肽或單克隆抗體在腫瘤的顯影和治療中已成為更具優(yōu)勢的候選分子,尤其是采用治療性放射性核素標(biāo)記靶向性小肽或單抗進(jìn)行放射治療更具前景。GX1短肽是我科郅敏等人[3]于2004年利用噬菌體環(huán)7肽庫體內(nèi)篩選技術(shù)從人胃癌的小鼠腎包膜下異種移植瘤模型中篩選出的環(huán)狀小肽(氨基酸序列為CGNSNPKSC)。前期各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[3-7]表明該短肽具有與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向結(jié)合的能力,但

3、以往的研究著重于GX1性質(zhì)的鑒定、PEG修飾和99Tcm標(biāo)記該短肽與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性的研究,而用131I標(biāo)記并用于顯影和治療方面的研究還尚未進(jìn)行,故本課題設(shè)計(jì)、合成酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽,研究131I標(biāo)記該修飾短肽(Tyr-GX1)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分子影像和體外放射治療研究,以探討將其應(yīng)用于體內(nèi)靶向腫瘤血管顯像和診治藥物的可能性。
　　【目的】
　　1、化學(xué)合成Tyr-GX1短肽,并對其化學(xué)性質(zhì)、受體結(jié)合性、

4、靶向性等進(jìn)行質(zhì)量鑒定,評價(jià)其是否與GX1短肽的性質(zhì)一致。
　　2、用131I標(biāo)記Tyr-GX1短肽,制備131I-Tyr-GX1同位素探針,并對其標(biāo)記率、穩(wěn)定性、放化純等性質(zhì)進(jìn)行鑒定,隨后進(jìn)行SPECT成像和Cerenkov光學(xué)成像,評估該探針在體內(nèi)對腫瘤血管的靶向性。
　　3、初步評估131I-Tyr-GX1短肽在體外細(xì)胞水平是否對共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞有放射抑制作用。
　　【方法】
　　1、根據(jù)氨基酸序列人工化學(xué)合成

5、Tyr修飾的GX1短肽,并進(jìn)行質(zhì)譜分析、化學(xué)性質(zhì)等鑒定;制備生物素標(biāo)記的Tyr-GX1短肽,細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察其在內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)/共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞(Co-HUVEC)的結(jié)合表達(dá)情況,根據(jù)細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度評價(jià)其對不同細(xì)胞的結(jié)合特異性;隨后用直接標(biāo)記法將放射性核素99mTc與Tyr-GX1或GX1短肽標(biāo)記,尾靜脈注射入不同皮下接種SGC7901/Lovo腫瘤細(xì)胞的裸鼠模型體內(nèi),在不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、12h、18h、24h)觀察

6、SPECT成像,利用計(jì)算機(jī)勾劃感興趣區(qū)(ROI)技術(shù),計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織與非腫瘤組織的放射性比值(T/NT),進(jìn)而來證實(shí)該修飾肽(Tyr-GX1)在體內(nèi)的腫瘤血管靶向性。
　　2、應(yīng)用Iodogen碘標(biāo)法直接將131I與Tyr-GX1短肽進(jìn)行標(biāo)記,并對其進(jìn)行標(biāo)記率、穩(wěn)定性及放化純等性質(zhì)分析,24h不同時(shí)間點(diǎn)SPECT成像和Cerenkov光學(xué)成像及生物學(xué)分布檢測,觀察131I-Tyr-GX1短肽是否在荷瘤裸鼠體內(nèi)具有較好的腫瘤

7、血管靶向性。
　　3、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、MTT法檢測131I-Tyr-GX1短肽在不同濃度下對Co-HUVEC的放射抑制作用。
　　【結(jié)果】
　　1、質(zhì)譜分析結(jié)果表明合成的短肽確實(shí)為Tyr-GX1短肽。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:Tyr-GX1與Co-HUVEC和HUVEC明顯結(jié)合,而與SGC7901細(xì)胞和GES細(xì)胞結(jié)合較弱;在Co-HUVEC上,Tyr修飾的GX1和單獨(dú)的GX1結(jié)合差異不明顯,而與對照

8、組URP相比,差異比較明顯。99Tcm分別標(biāo)記Tyr-GX1、GX1,測定標(biāo)記率后,尾靜脈注射入不同荷結(jié)腸癌裸鼠體內(nèi),24小時(shí)SPECT顯像結(jié)果顯示:99Tcm-Tyr-GX1與99Tcm-GX1顯像結(jié)果基本相似,裸鼠腫瘤部位從4h開始已顯影,于12h和18h最清楚,與99Tcm-URP相比,腫瘤部位攝取明顯高于URP對照組,說明Tyr-GX1與GX1相比,也同樣具有良好的腫瘤血管靶向性;24h體內(nèi)生物學(xué)分布顯示:99Tcm標(biāo)記的Tyr

9、-GX1/GX1主要分布在腎臟、肝臟和腫瘤,高于其他組織器管,這提示Tyr-GX1和GX1一樣都是通過腎臟代謝排出體外;24h時(shí)腫瘤組織與非腫瘤組織(肌肉、腦、血液、肝臟、腎臟)的放射性比值(T/NT)顯示,腫瘤組織的放射性聚集明顯高于腦、肌肉等非腫瘤組織。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:Tyr修飾的GX1和單獨(dú)的GX1在結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞、靶向性等方面性質(zhì)沒有發(fā)生變化。
　　2、Iodogen碘標(biāo)法結(jié)果顯示:131I標(biāo)記Tyr-GX1的標(biāo)記率>90

10、％、比活度計(jì)算為30ci/mmol(>10ci/mmol)、放化純>90%,24h不同時(shí)間點(diǎn)其穩(wěn)定性檢測,結(jié)果顯示:至24h時(shí),131I-Tyr-GX1的標(biāo)記率在不同溶液中(人血清、鼠血清、PBS、過量EDTA溶液)仍都維持在90﹪左右,表明131I-Tyr-GX1短肽在體內(nèi)外具有良好的穩(wěn)定性。隨后,我們將131I-Tyr-GX1尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)進(jìn)行雙模態(tài)成像,24h動(dòng)態(tài)SPECT成像顯示:腫瘤于12-18h時(shí)顯影較好,與同條件

11、下對照組131I-Tyr-RGD相比,具有相似顯影結(jié)果;體內(nèi)24h生物學(xué)分布顯示:標(biāo)記肽(131I-Tyr-GX1)在荷瘤裸鼠雙腎放射性計(jì)數(shù)測量最高,其次是肝臟、腫瘤等組織,腦、骨、肌肉等組織放射性計(jì)數(shù)含量較低;同時(shí),Cerenkov光學(xué)成像結(jié)果顯示荷瘤裸鼠腹腔部位和腫瘤部位顯影,結(jié)果與SPECT結(jié)果基本一致。
　　3、體外細(xì)胞抑制和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Na131I、Tyr-GX1、131I-Tyr-GX1在不同濃度下對Co-HUV

12、EC產(chǎn)生一定的抑制作用,且具有劑量濃度依賴關(guān)系,其中131I-Tyr-GX1的作用較強(qiáng),并在高濃度下對Co-HUVEC有一定的促凋亡和放射殺傷作用。
　　【結(jié)論】
　　1、成功設(shè)計(jì)、合成了單個(gè)氨基酸——酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽,經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,Tyr-GX1在化學(xué)性質(zhì)、結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤血管靶向性等方面性質(zhì)與GX1相比沒有發(fā)生變化;
　　2、應(yīng)用Iodogen碘標(biāo)法成功標(biāo)記了Tyr-GX1短肽,并獲得了具有較