胃癌血管靶向蛋白GX1-rmhTNFα的發(fā)酵純化工藝.pdf

1、胃癌是一種最常見的人類惡性腫瘤,居全球癌癥死亡率的第二大原因,預后較差,在我國,5年期胃癌的生存率低于20％-25％。早期胃癌可以通過手術切除,輔以放化療治療,極大提高患者的5年生存率。可是中晚期胃癌治療效果較差。隨著人們對腫瘤研究的深入,人們意識到腫瘤生長微環(huán)境,尤其是腫瘤的血管生成,對腫瘤的生長轉移的重要性。因此阻斷腫瘤血管生成成為了人們研究腫瘤治療的新方向。GX1-rmhTNFα是我們實驗室采用基因重組技術制備的一種抑制胃癌新生血

2、管形成的藥物。rmhTNFα在我國已經批準上市用于治療小細胞肺癌,GX1為我實驗室通過噬菌體肽庫篩選出來的靶向胃癌血管的環(huán)狀小肽,于是我們采用基因重組技術制備出GX1-rmhTNFα。前期實驗證明該藥物通過GX1特異結合于胃癌新生血管,從而使rmhTNFα在胃癌細胞周圍的新生血管富集,能有效地抑制胃癌血管生成,達到治療胃癌的作用。
　　目的:為了進一步加快GX1-rmhTNFα應用于臨床治療,本課題旨在通過全面檢定采用基因重組技術

3、構建的表達GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌(DH5α/pBV-GX1-rmhTNFα),從而建立穩(wěn)定的適合大規(guī)模生產的工程菌菌種庫,并建立發(fā)酵及純化的穩(wěn)定工藝。
　　方法:對GX1-rmhTNFα工程菌進行全面檢定,挑取目的蛋白表達水平高的菌種擴大培養(yǎng);采用5L發(fā)酵罐,32℃培養(yǎng)工程菌至A600值達4~6,42℃誘導約4h后收菌,發(fā)酵過程,控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法補料,連續(xù)發(fā)酵3批,驗證發(fā)酵工

4、藝的穩(wěn)定性;表達產物經硫酸銨分段鹽析及透析處理后活性為1.71×10~8IU/ml蛋白含量為5.918mg/ml,經SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF層析純化,收集洗脫峰進行濃度、活性、純度及Western blot分析。
　　結果:工程菌經全面檢定,證實該重組菌構建正確,目的蛋白表達量不低于10％,菌種穩(wěn)定性較好,呈典型的大腸桿菌特征,適合建立工程菌菌庫。連續(xù)發(fā)酵3批,濕菌收量均不低于200克,且各批菌

5、體目的蛋白表達水平均在10％以上。目的蛋白經SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF柱層析純化,最終純化產物蛋白含量為0.901mg/ml,活性為5.97×10~8IU/ml,純度可達95％以上,經Western blot檢測,目的蛋白可與相應單抗發(fā)生特異性免疫反應。
　　結論:采用基因重組技術構建的表達GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌穩(wěn)定,建立了簡單可行的表達GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌的發(fā)酵