版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領
文檔簡介
1、人表皮生長因子受體2(HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2,HER2)亦稱ErbB2。研究發(fā)現(xiàn),HER2分子過表達于胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種癌組織中,并在這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前,HER2分子已經(jīng)成為腫瘤治療領域的關鍵分子之一。研究人員一方面可以直接通過阻斷該分子介導的HER2信號轉(zhuǎn)導通路來抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展;另一方面可以通過該分子介導相應的抗腫瘤藥物進入腫瘤細
2、胞抑制或殺傷腫瘤細胞,從而治療HER2陽性腫瘤。
白喉毒素(DiphtheriaToxin,DT)是白喉桿菌所產(chǎn)生的外毒素,該毒素由535個氨基酸組成,包括具有核糖體依賴的酶活性的A片段和由受體結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)位區(qū)組成的B片段。DT的第187-196位氨基酸為轉(zhuǎn)位肽(稱為Fdt),可在內(nèi)吞體被Furin蛋白酶酶切,并使外源蛋白轉(zhuǎn)位至細胞質(zhì)中發(fā)揮相應生物學功能。
Bid蛋白是Bcl-2家族成員,分子量大小為22kD,該蛋白定
3、位于細胞質(zhì)中,可以被caspase8和GrB等多種蛋白酶切割,形成約為15kD的截短Bid(truncatedBid,tBid)片段,tBid從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體進而釋放細胞色素c激活其它促凋亡分子,誘導細胞凋亡。
前期研究中,我們構(gòu)建了由抗HER2分子的單鏈抗體e23sFv、轉(zhuǎn)位肽Fdt以及促凋亡蛋白tBid構(gòu)成的重組蛋白編碼基因,并將該基因?qū)胂鄳脑吮磉_載體,通過大腸桿菌表達、蛋白復性及純化得到高純度的具有較好生物活性
4、的帶His標簽e23sFv-Fdt-tBid重組蛋白。體外細胞學實驗表明該重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以特異性結(jié)合HER2分子并內(nèi)化入HER2陽性腫瘤細胞內(nèi)誘導靶細胞凋亡;動物體內(nèi)抑瘤實驗顯示該重組蛋白具有較好的抑瘤作用,并且與化療藥物聯(lián)合使用時效果更為顯著。重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid對腫瘤良好的殺傷和抑制作用顯示該重組蛋白有望成為新的抗腫瘤候選藥物并進入臨床應用。
然而上述研究僅限于重組抗腫瘤蛋白的實
5、驗室小量制備,并未作為候選藥物進行表達純化的工藝研究,同時,由于我們前期研究所獲得的重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid均為帶His標簽蛋白,不符合臨床藥物評審相關標準。為了使該藥物可以成為新的抗腫瘤候選藥物并進入臨床應用,我們在本研究中按照臨床藥物評審的要求,以無標簽蛋白生產(chǎn)及純化的方式進行了藥用HER2陽性腫瘤靶向治療促凋亡重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid表達及純化工藝研究。
首先,我們使用原核表達系統(tǒng)對重組蛋白質(zhì)
6、e23sFv-Fdt-tBid進行了表達并對相關表達和純化工藝進行了研究。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入原核表達載體PET-22b中以轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌,使用IPTG誘導后重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid以包涵體形式表達,但表達量較低并存在截短蛋白表達;經(jīng)過表達條件及密碼子優(yōu)化后重組蛋白表達量得以提高,但重組蛋白質(zhì)仍以包涵體形式表達并存在截短蛋白表達;通過菌種50次傳代實驗確定原核表達載體可以穩(wěn)定遺傳并
7、且可以穩(wěn)定表達重組蛋白質(zhì);通過透析復性、稀釋復性及色譜復性等多種復性實驗的嘗試發(fā)現(xiàn)該重組蛋白質(zhì)包涵體復性較為困難。
其次,我們使用畢赤酵母表達系統(tǒng)對重組蛋白質(zhì)e23sFv-Fdt-tBid進行了表達研究。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入酵母表達載體pPICZαA中,使重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid可以與載體中的α信號肽融合并進行分泌表達。隨后將重組載體電轉(zhuǎn)入畢赤酵母細胞GS115和KM71H中并進行陽性克
8、隆的篩選。SDS-PAGE與WesternBlot分析均未檢測到重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid在酵母細胞中的表達。
最后,我們還研究了重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid在哺乳動物細胞CHO中的表達。我們將e23sFv-Fdt-tBid基因克隆入pcDNA5/FRT載體,通過Flp-InTM定點整合系統(tǒng)使該基因整合到Flp-lnTMCHO宿主細胞基因組中的單拷貝位點上,以適當濃度的潮霉素B篩選得到定點整合重組蛋白基因
9、的細胞克隆并使用基因組PCR和Westernblot技術(shù)檢測重組蛋白的基因的整合及表達,結(jié)果表明CHO以分泌形式正確表達該重組蛋白并且不存在截短蛋白。
綜上所述,我們進行了藥用重組蛋白e23sFv-Fdt-tBid的表達及純化工藝研究,確定了較為合適的重組蛋白表達系統(tǒng)。該重組蛋白使用原核表達系統(tǒng)表達量較高并且蛋白表達穩(wěn)定,但在大腸桿菌中該重組蛋白以包涵體形式表達,復性較為困難。使用畢赤酵母的α信號肽分泌表達e23sFv-Fdt
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 重組人HER2蛋白的純化及抗HER2人源性抗體的初步篩選.pdf
- 免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID的基因構(gòu)建、表達及腫瘤靶向殺傷作用的研究.pdf
- HER2靶向性重組tBid分子對骨肉瘤SOSP-9607細胞的促凋亡作用.pdf
- 單鏈抗體e23sFv的人源化抗體制備及其在HER2靶向腫瘤殺傷中的功能鑒定.pdf
- Anti HER2 HER2 ScFv--GFP融合抗體靶向檢測HER2的實驗研究.pdf
- Her2及抗Her2抗體的純化與性質(zhì)的研究.pdf
- HER2靶向抗體抗高表達HER2腫瘤細胞生長與轉(zhuǎn)移的作用與機制研究.pdf
- 重組蛋白藥物純化與質(zhì)量控制
- 重組蛋白2-SH2的表達、純化、結(jié)構(gòu)分析及應用.pdf
- 惡性腦膜瘤細胞對HER2靶向藥物敏感性的研究.pdf
- 重組白蛋白(rHSA)純化工藝優(yōu)化研究.pdf
- HER2靶向重組型Caspase-6融合蛋白對骨肉瘤細胞的促凋亡作用.pdf
- her2陽性新輔助化療加用靶向治療藥物必要性
- 乳腺癌組織FISH檢測HER2基因與IHC檢測HER2蛋白的比較研究.pdf
- HER2基因擴增及蛋白表達與胃癌臨床的關系.pdf
- Her2靶向的小干擾RNA藥物輸送系統(tǒng)治療乳腺癌的研究.pdf
- 生殖支原體MgPa重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究.pdf
- 糞腸球菌Ace重組蛋白的表達、純化及黏附活性研究.pdf
- 胰腺癌HER2和HER4蛋白表達和基因狀態(tài)分析.pdf
- 具有不同轉(zhuǎn)位肽段的重組Immuno-tBid分子的基因構(gòu)建、表達及對HER2陽性腫瘤細胞的殺傷作用.pdf
評論
0/150
提交評論