免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID的基因構(gòu)建、表達(dá)及腫瘤靶向殺傷作用的研究.pdf

1、重組免疫毒素是一類重要的腫瘤靶向性治療藥物。由具有細(xì)胞選擇性作用的導(dǎo)向分子和細(xì)菌或植物毒素組成，它能特異性殺傷靶細(xì)胞，而不損傷正常組織細(xì)胞，可用于腫瘤、組織器官移植、自身免疫性疾病、HIV感染等免疫相關(guān)疾病。盡管重組免疫毒素具有廣闊的應(yīng)用前景，但是在臨床應(yīng)用中仍面臨許多挑戰(zhàn)，如免疫原性強(qiáng)和穿透性差，解決方法之一就是構(gòu)建小分子人源化的重組免疫毒素。
　　Bid（BH3-interactingdeathagonist）是Bcl-2家族

2、BH3亞家族的一個成員，具有促凋亡活性。Bid蛋白只含BH3結(jié)構(gòu)域，全長為195aa，分子量22KDa。Bid位于細(xì)胞漿，當(dāng)其被活化的Caspase-8或其他蛋白酶切割后，去除N末端片段，產(chǎn)生的截短體片斷（truncatedBid,tBid；15kDa）從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體，主要通過控制細(xì)胞色素c（Cytc）和其它促凋亡分子的釋放來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　HER2是癌基因erbB2/neu的表達(dá)產(chǎn)物，能傳導(dǎo)生長信號而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖

3、。HER2是目前公認(rèn)的腫瘤細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子，在乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，是一種理想的治療靶點。
　　因此，以抗HER2單鏈抗體為導(dǎo)向分子，以人活性促凋亡分子tBid為毒性部分構(gòu)建的重組免疫促凋亡分子是一種潛在的免疫原性低、穿透力強(qiáng)的抗腫瘤藥物。
　　本研究中構(gòu)建的重組免疫促凋亡分子由抗HER2單鏈抗體e23sFv和活性促凋亡分子tBid構(gòu)成，白喉毒素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域中含有Furin酶切位點的十肽（187aa-196aa

4、）插入其間，連接導(dǎo)向分子和毒素分子。將重組基因克隆入原核表達(dá)載體pQE30，轉(zhuǎn)化宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)親和層析純化、透析復(fù)性后，獲得e23sFv-TD-tBID融合蛋白。進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性。
　　細(xì)胞ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光結(jié)果顯示，e23sFv-TD-tBID能特異地結(jié)合并內(nèi)化入HER2陽性腫瘤細(xì)胞，對HER2陰性的細(xì)胞無此作用。MTT結(jié)果顯示，e23sFv-TD-tBID能明顯抑

5、制HER2陽性腫瘤細(xì)胞的生長，對HER2高表達(dá)的SK-BR-3、SKOV-3細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)，這說明e23sFv-TD-tBID對靶細(xì)胞的殺傷作用和細(xì)胞表面HER2分子表達(dá)量密切相關(guān)。e23sFv-TD-tBID通過誘導(dǎo)凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞生長。此外，我們還從乳腺癌病人的胸水中分離培養(yǎng)原代乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)e23sFv-TD-tBID也可以結(jié)合并殺傷HER2陽性的原代乳腺癌細(xì)胞。
　　動物實驗結(jié)果顯示，單獨使用e23sFv-TD-tB

6、ID治療可以抑制荷瘤裸鼠腫瘤的生長，這種抑制作用具有劑量依賴性，在治療期間未見明顯的毒副作用。當(dāng)e23sFv-TD-tBID與化療藥物聯(lián)合使用時，抑瘤作用更加顯著。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了重組免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID，經(jīng)原核表達(dá)、純化、復(fù)性，獲得e23sFv-TD-tBID融合蛋白。體外細(xì)胞學(xué)實驗表明，e23sFv-TD-tBID能特異性結(jié)合并內(nèi)化入HER2陽性腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡，體內(nèi)抑瘤實驗表明，e23sF