HER2靶向性重組tBid分子對(duì)骨肉瘤SOSP-9607細(xì)胞的促凋亡作用.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma) 是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤。20世紀(jì)70年代以前，主要治療方法是截肢和關(guān)節(jié)離斷，從外科治療到出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的平均時(shí)間為8個(gè)月，5年生存率<25％。隨著外科技術(shù)和影像學(xué)的發(fā)展，新輔助化療和免疫治療的進(jìn)步，骨肉瘤治愈率有了明顯改進(jìn)，5年生存率達(dá)到80％。但目前的治療手段仍無(wú)法解決腫瘤病人的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和藥物耐藥等情況，腫瘤的基因靶向性分子治療的出現(xiàn)為骨肉瘤的治療開辟了一條新的治療途徑。 Bi

2、d（BH3-interacting domain death agonist）是一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員蛋白，全長(zhǎng)為195aa，分子量為22kDa。Bid位于細(xì)胞漿內(nèi)，在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中, 可引起Caspase-8聚集活化,活化的Caspase-8切割Bid，去除N末端片段，形成活性的截短的Bid ( truncated Bid，tBid)分子。tBid的分子量為15kDa，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體中，通過(guò)

3、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素c（Cyt c）釋放和其他線粒體凋亡分子調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程。 HER2/neu分子是癌基因erbB2的編碼產(chǎn)物，其編碼基因定位于人染色體17q21，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體家族的成員之一。通常情況下，HER2/neu只在胎兒時(shí)期表達(dá)，到成年以后，僅有低水平表達(dá)于細(xì)胞表面。HER2/neu的過(guò)度表達(dá)存在于多種腫瘤組織，如轉(zhuǎn)移性乳腺癌（25％-30％）、炎癥性乳腺癌（50％）、轉(zhuǎn)移性導(dǎo)管

4、癌（60-70％）、非小細(xì)胞肺癌（13-55％）、卵巢癌（18-43％）、子宮內(nèi)膜癌（10-52％）、直腸結(jié)腸癌（33-85％）、腎癌（22-36％）、頭頸癌（16-50％）、胃癌（21-64％）、食道癌（10-26％）、前列腺癌（5-46％）等。另40-44％成骨肉瘤及58％成骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移等，成為一種公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物。 本研究將信號(hào)肽、單鏈抗體、來(lái)源于綠膿桿菌的具有膜轉(zhuǎn)位作用的肽段和tBid融合，構(gòu)建分泌型靶向促凋亡分子Imm

5、uno-tBid（pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-tBid61，即pCMV-5-2），使其能特異性識(shí)別、內(nèi)化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞液中，誘導(dǎo)HER2陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞凋亡。 首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將tBid基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-9607，通過(guò)間接免疫熒光法、流式細(xì)胞儀及電鏡等方法，對(duì)tBid的促調(diào)亡活性進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示tBid在骨肉瘤細(xì)胞中能夠有效得到表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體的對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞膜完

6、整，而轉(zhuǎn)染pcDAN3-tBid61的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則變得較少，形態(tài)發(fā)生改變，體積變小并且固縮。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜出胞，胞核濃縮，染色質(zhì)聚集等凋亡特征。使用流式細(xì)胞儀、Annexin V和PI雙染，監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸外翻情況，結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞（6％）相比，實(shí)驗(yàn)組早期調(diào)亡和凋亡繼發(fā)死亡率為35.8％。 進(jìn)一步采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的活性tBid 融合蛋白基因（pCMV-5-2）轉(zhuǎn)染HER2陽(yáng)性骨肉瘤SOS

7、P-9607細(xì)胞，觀察其對(duì)骨肉瘤SOSP-9607細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。通過(guò)間接免疫熒光的方法從細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化來(lái)檢測(cè)凋亡，觀察到轉(zhuǎn)染目的基因后有細(xì)胞固縮、核濃縮等凋亡特征。進(jìn)一步通過(guò)Annexin V染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)，與對(duì)照組細(xì)胞（6％）相比，凋亡率為42％，表明細(xì)胞膜表面有磷脂酰絲氨酸外翻，說(shuō)明重組Immuno-tBid基因表達(dá)后有促凋亡作用。 將pCMV-5-2基因用脂質(zhì)體包裹，肌肉注射荷有HER2陽(yáng)性骨肉瘤（SOSP-

8、9607）的裸鼠，可觀察到治療組瘤體生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Immuno-tBid蛋白選擇性地分布于治療組裸鼠的腫瘤組織和肌肉組織中，其他組織如心、肝、脾、肺、腎臟中，以及在對(duì)照組腫瘤組織中，染色呈陰性或弱陽(yáng)性，后者可能是內(nèi)源性Bid表達(dá)的結(jié)果。進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色，可檢測(cè)到治療組的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性。以上結(jié)果表明Immuno-tBid選擇性地分布于HER2陽(yáng)性的腫瘤組織中，并通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞凋亡