靶向HPVE6E7基因的TALEN的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、研究目的：
　　1.分析HPV16/18 E6/E7癌基因序列信息，構(gòu)建靶向于HPV16/18 E6/E7不同靶點(diǎn)的TALEN質(zhì)粒，利用體外的報(bào)告系統(tǒng)初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的TALEN；同時(shí)對(duì)TALEN的FokI切割域和骨架系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，篩選出切割效率最高的的TALEN。
　　2.再將TALEN應(yīng)用到各種細(xì)胞系中，從E6E7 DNA拷貝數(shù)的變化、細(xì)胞內(nèi)靶序列的切割效率、癌蛋白表達(dá)情況、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖等方面

2、驗(yàn)證TALEN的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)和特異性。
　　3.以mRFP表達(dá)建立小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系，評(píng)價(jià)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的基因表達(dá)、分布等情況，再以靶向 EGFP的TALEN質(zhì)粒（TAL-EGFP）轉(zhuǎn)染到系統(tǒng)表達(dá) EGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)，利用EGFP熒光表達(dá)評(píng)價(jià)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染TALEN的作用效果，以此優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，為后續(xù)在轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染靶向HPV的TALEN表達(dá)質(zhì)粒治療CIN或?qū)m頸癌建立基礎(chǔ)，為CIN或?qū)m頸癌的治療與預(yù)防提供新的策略。

3、r>　　研究方法：
　　1.分析高危性HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列，在E6E7癌基因翻譯起始點(diǎn)或主mRNA剪接體的起始外顯子之內(nèi)挑選出作用靶點(diǎn)，利用Golden Gate Assembly的方法構(gòu)建TALEN質(zhì)粒共計(jì)16對(duì)，隨后利用SSA reporter報(bào)告系統(tǒng)對(duì)所有的TALEN進(jìn)行篩選；突變野生型的FokI切割域，將FokI突變體和兩種TALEN骨架進(jìn)行組合并同樣用SSA reporter系統(tǒng)篩選效率最高毒副作用

4、最小的組合方式進(jìn)行組裝優(yōu)化。
　　2.將優(yōu)化的TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細(xì)胞系，利用T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DSB用于間接反應(yīng)TALEN在細(xì)胞內(nèi)的切割效率；熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HPV E6 E7基因的拷貝數(shù)變化；Western blotting檢測(cè)HPV16/18 E6 E7癌基因及其下游基因的蛋白表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　3.采用單次或

5、多次不同劑量給藥的方式在小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染mRFP表達(dá)質(zhì)粒，小鼠陰道脫落細(xì)胞直接鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率；選取不同給藥劑量的不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，取出小鼠宮頸陰道部組織，冰凍切片觀察紅色熒光在組織內(nèi)的分布情況，優(yōu)化陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的條件；再按照此條件在EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染FLAG標(biāo)記的靶向EGFP的TAL-EGFP，取組織冰凍切片觀察EGFP綠光變化情況，再用4％多聚甲醛固定后石蠟包埋切片，通過(guò)攜帶的FLAG標(biāo)簽的免疫組化染色

6、確定TAL-EGFP質(zhì)粒的表達(dá)在組織內(nèi)的分布情況。通過(guò)HE染色和小鼠CD45的免疫組化染色確定轉(zhuǎn)染是否誘導(dǎo)局部的炎癥。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)過(guò)SSA reporter系統(tǒng)的篩選，所有構(gòu)建的16對(duì)TALEN質(zhì)粒均能有效的切割DNA，切割效率最好的分別是靶向于HPV16 E6的T27，靶向于HPV16 E7的T512，靶向于HPV18 E6的T34和靶向于HPV18 E7的T519；+63截短型骨架與S+KKR/ELD的突

7、變型FokI的組合的切割效率最高，因此將上述4對(duì)TALEN質(zhì)粒全部裝上這一骨架系統(tǒng)。
　　2.將優(yōu)化的4對(duì)TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細(xì)胞后，(1) T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)T27或T512處理的SiHa和S12細(xì)胞、T34或T519轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞樣品均得到陽(yáng)性的結(jié)果。(2)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T512轉(zhuǎn)染后的SiHa和S12細(xì)胞里的HPV16 DNA拷貝數(shù)降低，T519處理后的HeLa細(xì)胞里

8、的HPV18 DNA拷貝數(shù)降低。(3) Western blotting結(jié)果顯示T27、T34能特異性的誘導(dǎo)HPV16 E6和HPV18 E6蛋白的下調(diào)，同時(shí)檢測(cè)到E6下游的靶蛋白p53的上調(diào)；T512、T519能特異性的誘導(dǎo)HPV16 E7和HPV18 E7蛋白的下調(diào)，以及E7下游的CDK2蛋白的表達(dá)上調(diào)。(4)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示T27和T512僅能引起HPV16陽(yáng)性的細(xì)胞系SiHa和S12的明顯凋亡，對(duì)HPV18陽(yáng)性的HeLa無(wú)明顯誘

9、導(dǎo)凋亡作用；T34和 T519僅能引起HeLa的凋亡，而對(duì)SiHa無(wú)明顯作用；所有這4對(duì)TALEN對(duì)HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系C33A和正常人胚腎細(xì)胞系293T都無(wú)誘導(dǎo)凋亡作用。(5)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示， T27和T512僅特異性的抑制SiHa和S12的細(xì)胞增殖，對(duì)HeLa、C33A、293T的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用；T34和T519僅特異性的抑制HeLa的增殖，對(duì)其他4株細(xì)胞系均無(wú)明顯影響。
　　3.mRFP質(zhì)粒在小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染后48小

10、時(shí)即可檢測(cè)到明顯的發(fā)光情況，并且至少6天內(nèi)可觀察到熒光；通過(guò)比較不同濃度不同轉(zhuǎn)染量的發(fā)光情況，對(duì)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系進(jìn)一步的優(yōu)化；觀察到轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達(dá)范圍大部分限定在宮頸和陰道的上皮內(nèi)；陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的TAL-EGFP可以在體內(nèi)有效的切割EGFP表達(dá)序列，阻止EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)的EGFP蛋白的繼續(xù)表達(dá)，使得宮頸陰道局部的EGFP熒光減弱甚至消失；證明體內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)局部無(wú)損傷，不會(huì)誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.對(duì)構(gòu)建

11、出8對(duì)靶向于HPV16 E6E7和8對(duì)靶向于HPV18 E6E7的TALEN質(zhì)粒進(jìn)行篩選后得出效果最好的4對(duì)分別是靶向于HPV16 E6的T27，靶向于HPV16 E7的T512，靶向于HPV18 E6的T34和靶向于HPV18 E7的T519，并對(duì)FokI切割域和骨架系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。
　　2.T27、T512、T34和T519在相應(yīng)HPV陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)有效的切割靶向HPV序列，引起HPV拷貝數(shù)的降低，相應(yīng)HPV癌基因表達(dá)的下調(diào)以及