單鏈抗體e23sFv的人源化抗體制備及其在HER2靶向腫瘤殺傷中的功能鑒定.pdf

1、HER2（p185erbB2/neu）是EGFR家族的成員，在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤細胞中高表達，是腫瘤惡性行為以及不良預后的標志。靶向治療是 HER2陽性腫瘤的重要治療手段，主要包括靶向 HER2的單克隆抗體、單鏈抗體偶聯(lián)效應分子等策略。HE R2治療性單克隆抗體能夠有效抑制腫瘤細胞增殖、延長生存期，是HE R2陽性進展期乳腺癌及胃癌的一線療法。這些H ER2靶向的治療性抗體都由鼠源單克隆抗體經(jīng)人源化改造而來，長期應用未

2、觀察到嚴重的免疫原性相關(guān)副作用。HE R2單鏈抗體來源于單克隆抗體，常與生物效應分子融合表達或者表達于T細胞表面（CAR-T）靶向殺傷腫瘤細胞，具有廣泛的應用價值。對鼠源單鏈抗體的人源化改造，是以其為基礎(chǔ)的腫瘤靶向殺傷策略走向臨床的重要一環(huán)。本研究以本組前期系列驗證的、靶向效果明確的鼠源單鏈抗體e23sFv為模板，擬解決兩個關(guān)鍵問題：一是在探索單鏈抗體人源化的技術(shù)改進；二是評價該人源化單鏈抗體用于腫瘤靶向治療的有效性。
　　針對第

3、一個關(guān)鍵問題，本研究進行了兩方面新的摸索。首先，在傳統(tǒng)的鼠源互補決定區(qū)（CDR）—人源框架區(qū)（FR）移植策略的基礎(chǔ)上，拓寬了人源化改造 FR模板的選擇范圍，既選了與e23sF v同源性最高的全人抗體特異序列，也選了與e23sF v同源性最高的全人抗體亞類的通用序列，并將二者對比，為抗體人源化的FR模板選擇提供線索。其次，針對所選的人源抗體亞類通用序列，將FR關(guān)鍵殘基突變回鼠源親本，以維持抗原構(gòu)象、避免喪失親和力。傳統(tǒng)的突變策略有兩種：一

4、是定點突變，前提是抗體結(jié)構(gòu)信息必須明確；二是隨機突變，雖然可提高親和力的多樣性，但篩選工作量大。嘗試將這二者相結(jié)合，選擇13個關(guān)鍵氨基酸位點分別設(shè)計定點突變引物，同時又通過設(shè)計同位點的不突變對照、引物的隨機組合分組等方法，增加這13個位點隨機突變與組合的幾率，最終結(jié)合噬菌體抗體展示技術(shù)，建立了庫容為213的突變抗體庫，經(jīng)4輪親和力淘選和噬菌體ELIS A篩選，獲得4株高親和力的人源化單鏈抗體。
　　基于上述構(gòu)建和篩選，本研究得到2

5、株特異序列來源的人源化單鏈抗體SGF1、SGF2，4株通用序列來源的人源化單鏈抗體P1 h2、P1 h3、P2 h2、P2 h5。通過同源建模的方法，模擬了e23sFv、SGF1、P1h2的結(jié)構(gòu)并與HER2分子進行對接，預測人源化單鏈抗體的識別表位位于HER2胞外段第IV結(jié)構(gòu)域，且SGF1主鏈碳原子構(gòu)象比P1h2更接近e23sFv，而P1h2與HER2相互作用能比SGF1更強。經(jīng)過原核蛋白表達純化、包涵體復性，獲得蛋白純度大于90％，進

6、行功能評價：①親和力：通過表面等離子共振實驗（SPR）觀察人源化單鏈抗體對人重組 HER2的親和力，結(jié)果顯示P1h2、P1 h3、SGF1比e23sF v提高約10倍，P2 h2、P2 h5則與e23 sFv相當；細胞ELISA觀察它們對細胞表面天然表達HER2的親和力，結(jié)果與SPR實驗一致。②識別表位：熒光素標記人源化單鏈抗體，競爭性流式細胞術(shù)觀察到，人源化單鏈抗體的 HER2識別表位與e23sFv相同。③內(nèi)化活性：激光共聚焦顯微鏡觀

7、察結(jié)果表明，熒光素標記的人源化單鏈抗體 P1h2、P1h3、SGF1能夠特異性結(jié)合并內(nèi)化進入 HER2陽性細胞；P2h2、P2h5、SGF2則不能內(nèi)化。④免疫原性：ELISPOT及抗體偶聯(lián)磁珠技術(shù)檢測人源化單鏈抗體刺激細胞因子分泌的水平，結(jié)果表明，人源化單鏈抗體刺激PBMCs產(chǎn)生 IFN-γ、TNF-α細胞因子的水平較鼠源單鏈抗體大幅下降，減少到鼠源單鏈抗體刺激水平的1/20。值得注意的是，特異序列來源的SGF1比通用序列來源的4株人源

8、化單鏈抗體刺激細胞因子分泌的水平更高，提示其免疫原性相對較強。綜上，從6株不同序列來源的人源化單鏈抗體中，優(yōu)選出兩株免疫原性低、親和力高并且具有內(nèi)化活性的單鏈抗體P1h2和P1h3，進行后續(xù)功能研究。
　　針對第二個關(guān)鍵問題，探索了P1h2和P1 h3用于兩種靶向治療策略的有效性：一是基于補體依賴的細胞毒作用（CDC）的間接腫瘤殺傷；二是基于本組前期建立成熟的免疫促凋亡策略的直接腫瘤殺傷。①C DC策略：在人源化單鏈抗體的C端融合

9、表達人 IgG1Fc，構(gòu)建獲得系列 scF v-Fc融合蛋白，進行真核系統(tǒng)表達純化。流式細胞術(shù)和體外CDC實驗結(jié)果表明，P1h2-Fc、P1h3-Fc融合蛋白均能與HER2陽性腫瘤細胞特異性結(jié)合，間接殺傷腫瘤細胞。HER2高表達的乳腺癌細胞及中度表達的肺癌細胞中，P1h2-Fc、P1h3-Fc的殺傷作用均強于e23sFv-Fc。②免疫促凋亡策略：將人源化單鏈抗體構(gòu)建替換入課題組前期建立的免疫促凋亡分子，獲得scFv-Fdt-tBid，進

10、行原核系統(tǒng)可溶表達純化。流式細胞術(shù)和細胞殺傷實驗觀察到， P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid能夠特異性結(jié)合HER2陽性腫瘤細胞，有效抑制細胞增殖；在 HE R2高表達的乳腺癌細胞、胃癌細胞、中度表達的肺癌細胞中，二者對腫瘤細胞的增殖抑制與e23sFv-Fdt-tBid相當。體內(nèi)實驗分別采用NOD-SCID鼠的三種不同荷瘤模型（乳腺癌原位瘤、胃癌原位瘤、肺癌皮下移植瘤），明確觀察到人源化改構(gòu)免疫促凋亡分子的體內(nèi)抗腫瘤活

11、性。在乳腺癌和胃癌模型中，P1h2-Fdt-tBid、P1h3-Fdt-tBid的腫瘤抑制作用強于 e23sF v-Fdt-tBid；而肺癌模型中，二者的抗腫瘤作用與e23sFv-Fdt-tBid相當。
　　綜上所述，本研究通過優(yōu)化CDR移植策略，針對抗HER2鼠源單鏈抗體e23sF v進行人源化改構(gòu)，成功篩選獲得免疫原性降低、親和力提高并具有內(nèi)化活性的兩株人源化單鏈抗體 P1h2、P1 h3，并通過體內(nèi)外實驗驗證其用于 CDC策