小鼠瘦素(mLeptin)的體外表達、純化及活性的研究.pdf

1、瘦素leptin是由肥胖基因(obese gene，OB)編碼，主要由白色脂肪細胞合成分泌的一類蛋白質(zhì)激素，對調(diào)節(jié)能量代謝和攝食具有重要作用。論文對小鼠瘦素分別在大腸桿菌BL21和畢赤酵母GS115中的誘導(dǎo)表達進行研究，結(jié)果顯示利用三刺搖瓶目的蛋白在大腸桿菌BL21中表達量提高到12g/L，結(jié)合緩慢稀釋透析的方法大大提高了活性目的蛋白的回收率?；诋叧嘟湍窯S115作為表達系統(tǒng)表達效率不高，研究畢赤酵母GS115在不同碳源培養(yǎng)基中胞內(nèi)胞

2、外蛋白質(zhì)組的區(qū)別，為以后構(gòu)建新的畢赤酵母表達菌株，外源蛋白表達系統(tǒng)的優(yōu)化提供一定的指導(dǎo)意義。
　　 大腸桿菌BL21作為表達系統(tǒng)：構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒PET-28a-His-mleptin轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達，目的蛋白幾乎均以包涵體的形式存在，最佳誘導(dǎo)表達條件：IPTG濃度0.1mmol/L，誘導(dǎo)時間6h，誘導(dǎo)溫度為37℃。經(jīng)變性復(fù)性和Ni2+親和樹脂交換柱純化后，得到純度高于95％的活性蛋白約5.2g/L，回收率達到

3、43.3％。純化后的His-mleptin蛋白經(jīng)腹腔注射C57/BL6小鼠，實驗組的體重和攝食量相對于對照組明顯降低，表明純化后的重組蛋白具有生物活性。
　　 畢赤酵母GS115作為表達系統(tǒng)：構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pPICZα-His-mleptin電轉(zhuǎn)化GS115菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達，表達量較低，不具應(yīng)用價值。利用LC-ESI-MS/MS結(jié)合Griffin等的歸一化非標定量法SIN得到GS115胞內(nèi)胞外詳盡的蛋白質(zhì)種類及準確百分含量