胸腺素α(l)基因的表達及產物純化和活性檢測的初步研究.pdf

1、本試驗旨在研究胸腺素α(l)的表達和活性檢測，探索出基因工程生產胸腺素α(l)的途徑和方法。試驗根據大腸桿菌密碼子偏愛性設計Tα(l)基因，由生物公司合成并連接到pMD18-T載體上。pMD18-T載體經BamHⅠandHindⅢ雙酶切回收的胸腺素α(l)插入到同樣雙酶切回收的pET-32a，轉化大腸桿菌DH5α。連接質粒測序正確后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，重組菌經氨芐青霉素篩選，IPTG誘導，15％SDS-PAGE檢測Tα(l

2、)融合蛋白獲得了高水平表達，表達的融合蛋白主要以可溶性形式存在于細胞周質。誘導表達菌重懸于TE(pH8.0)后高壓破碎菌體，利用Ni2+能與融合蛋白上的多聚組氨酸結合進行Ni2+柱親和層析純化，收集的洗脫蛋白峰15％SDS-PAGE檢測純化效果。通過BALB/c小鼠脾淋巴細胞轉化實驗測定純化胸腺素α(l)融合蛋白對小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響。試驗結果如下:
　　 1.重組質粒pET-32a-Tα(l)轉化到大腸桿菌BL21(DE

3、3)，經IPTG誘導，用15％SDS-PAGE檢測胸腺素α(l)的表達。結果顯示，用5mmol/LIPTG連續(xù)誘導5h，目的蛋白可實現高效表達。
　　 2.重組菌體溶于TE后高壓破碎，濾膜過濾后進行Ni2+柱親和層析純化，收集的洗脫蛋白峰15％SDS-PAGE確定純化效果。結果顯示，用Ni-NTA樹脂可有效地純化胸腺素α(l)。
　　 3.制備BALB/c小鼠脾淋巴細胞懸液，稀釋至適宜的細胞濃度，加入到細胞培養(yǎng)板，CO2