胸腺融合肽Tα1-TP5的表達、純化和活性研究.pdf

1、胸腺五肽（thymopentin，TP5）是位于胸腺生成素Ⅱ的第32～36位氨基酸殘基片段，具有與TPⅡ相似的生物學活性，能雙向調節(jié)失衡的免疫系統(tǒng)。TP5能誘導T細胞的分化，促進T淋巴細胞亞群發(fā)育并活化，是一種重要的免疫調節(jié)劑，臨床上主要用于免疫缺陷癥和自身免疫性疾病的治療。因TP5半衰期較短（30 s），人們制備了許多TP5的類似物或模擬肽來延長TP5的半衰期并提高其活性，如在TP5之間插入穩(wěn)定性成分、用D-型氨基酸取代L-型氨基酸，

2、或者制成環(huán)肽等，盡管這些工作取得了一定的成績，但結果卻難以令人滿意。 Tα1是一種天然存在于多種生物組織的多肽物質，由28個氨基酸殘基組成，等電點4.2，分子量3108 Da。Tα1具有與TP5類似的免疫活性，主要是增強細胞免疫，用于免疫缺陷或免疫功能低下相關的疾病。Tα1的血漿半衰期約1.5 h。目前，Tα1主要從動物組織中提取或化學合成，但從組織中提取存在產量低、產物不穩(wěn)定等缺點，而化學合成則價格昂貴。 為了提高T

3、P5的活性，延長其半衰期，本研究依據(jù)肽鏈延長可提高多肽類藥物體內半衰期的事實，將具有相似生物活性與臨床用途的TP5和Tα1借助基因工程方法連接在了一起，表達制備了Tα1-TP5融合肽。 1、Tα1-TP5融合肽的基因克隆及在畢赤酵母中的表達 本研究根據(jù)Tα1-TP5的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏愛的密碼子，人工設計合成了Tα1-TP5全基因序列；借助Primer軟件，設計了上下游引物，通過PCR反應、酶切、連接等步驟，構建

4、了融合基因Tα1-TP5表達載體pGAPZαA-Tα1-TP5。 由于在畢赤酵母中表達融合肽可能出現(xiàn)N-端和c-端不均一的現(xiàn)象，在構建表達載體時時采取了兩種方法：第一，將目的基因直接插在α-信號肽后面的Glu-Ala-Glu-Ala處；第二，在目的基因C-端增加了凝血酶酶切位點的編碼基因，保留了6×His純化標簽。這樣，既能簡便快捷的用金屬鰲合親和填料純化表達產物，又能通過凝血酶高效完全地切除N-端多余氨基酸殘基和6×His標簽

5、，得到Tα1-TP5融合肽，從而提高Tα1-TP5融合肽的純化效率。 采用電激法用BlnⅠ線性化載體pGAPZαA-Tα1-TP5轉化P.pastoris GS115，篩選Zeocine高抗性的陽性克隆，用煮-凍-煮法提取酵母基因組DNA，用PCR方法對P.pastoris GS115的基因表型進行了鑒定。重組轉化子經搖瓶培養(yǎng)，Tricine-SDS-PAGE證明上清液中含有Tα1-TP5融合肽，其中兩個轉化子表達量較高?？疾榱?/p>

6、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度對Tα1-TP5融合肽表達量的影響。結果顯示，在30℃、72 h后發(fā)酵上清中的Tα1-TP5表達量最高，達32.2 mg/L。 2、Tα1-TP5融合肽的分離純化 研究了Tα1-TP5融合肽的分離純化工藝。發(fā)酵混合物經高速離心取上清，用超濾法去除大分子的蛋白酶、金屬螯和層析純化融合肽、冷凍干燥濃縮、SephadexG-25凝膠過濾脫鹽、凝血酶酶切后用SephadexG-70凝膠過濾分離，再干燥濃縮，目的

7、產物Tα1-TP5融合肽在Tricine-SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶。ESI-MS也證實了Tα1-TP5融合肽在畢赤酵母中得到正確的分泌表達。 3、Tα1-TP5融合肽的二級結構研究 利用圓二色譜（Circular Dichroism，CD）與傅立葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）對Tα1-TP5融合肽的二級結構進行了分析。CD結果顯示Tα1-

8、TP5融合肽中二級結構的各構象分別是α-helix為32.01％，β-antiparallel為8.50％，β-parallel為8.86％，β-turn為17.02％，random coil為33.61％，說明Tα1-TP5融合肽分子結構中，α-helix和random coil是二級結構的主要部分。該結果FTIR的分析結果基本一致，二種分析方法相互補充，相互印證。 4、Tα1-TP5融合肽體外半衰期的研究 從家兔心臟

9、取血后進行肝素抗凝，加入一定濃度的多肽藥物，37℃水浴，于不同的時間點取樣，用鹽酸丙酮（鹽酸：丙酮：水=1：40：5，v/v）對血漿樣品進行處理，高速離心得到沉淀，用醋酸溶解。用RP-HPLC測定不同保溫時間血漿中Tα1-TP5、Tα1及TP5的濃度，計算Tα1-TP5、Tα1及TP5體外血漿半衰期。結果表明，Tα1-TP5、Tα1及TP5的血漿半衰期分別為140±14 min、127±11 min和5.6±0.7 min。Tα1-TP

10、5融合肽較TP5的體外血漿半衰期有明顯差異（P〈0.01）。 5、Tα1-TP5融合肽的活性研究 小鼠脾細胞增殖實驗表明，在系列濃度為10-11～106mol/L時，Tαl-TP5融合肽對昆明小鼠脾淋巴細胞的的最大增殖率為50.97±5.19％，Tα1的最大增殖率為45.38±8.26％，TP5融合肽的最大增殖率為40.61±5.17％，Tα1-TP5融合肽與TP5之間有顯著性差異（p<0.01）。 在巨噬細胞的

11、吞噬實驗中，Tα1-TP5融合肽組、Tα1組、TP5組和對照組的廓清指數(shù)K分別為0.020±0.0010、0.016±0.0007、0.013±0.0008和0.005±0.0006，而對應的吞噬指數(shù)依次為3.95±0.19、3.73±0.56、3.43±0.29和2.48±0.40。結果表明，各藥物組均能影響正常小鼠單核巨噬細胞吞噬功能，且融合肽的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α也顯著高于其它組（P<0.01）。 通過研究Tα1-TP5

12、、Tα1和TP5對小鼠血清中IL-2的表達的影響表明，Tα1-TP5融合肽組的平均水平為848.81±46.70 pg/mL，Tα1組的平均水平為761.50±31.33 pg/mL，而TP5組的平均水平為749.62±29.08 pg/mL，對照組為718.35±32.16 pg/mL，融合肽較其它實驗組有顯著性差異（P<0.01）。這表明Tα1-TP5融合肽較Tα1和TP5能更有效地促進淋巴細胞分泌IL-2。 考慮到Tα1-

13、TP5融合肽的結構與功能的關系，認為Tα1-TP5融合肽免疫活性的提高是由于Tα1-TP5構象的微小變化，尤其是α-helix含量的升高引起的。因為α-helix被認為是Tα1的主要活性中心，α-helix含量的升高，不僅顯著延長了Tα1-TP5融合肽的半衰期，而且Tα1-TP5融合肽與靶細胞的持久作用更有利于免疫活性的增強。 本實驗結果表明，Tα1-TP5融合肽具有潛在的臨床應用價值。 本研究取得的主要成果有：

14、（1）構建了pGAPZαA-Tα1-TP5表達載體，并采用畢赤酵母表達系統(tǒng)對Tα1-TP5融合肽進行了分泌表達，表達量可達32.2 mg/L，用ESI-MS證實了其結構的正確性。 （2）建立了實驗室水平的Tα1-TP5融合肽分離純化工藝，經過超濾、親和層析和凝膠過濾三步驟，所獲得產品的純度可達到99％以上。 （3）用CD和FTIR研究了Tα1-TP5融合肽的二級結構，表明α-helix和random coil是其二級結構的主

15、要組成部分。推測Tα1-TP5融合肽二級結構中的α-helix構象是影響其活性的重要因素。 （4）與TP5和Tα1相比較進行了Tα1-TP5融合肽體外血漿t1/2研究，顯示Tα1-TP5融合肽的半衰期約為140±14 min，高于同比試驗TP5（5.6±0.7 min）和Tα1（127±11min）。 （5）進行了胸腺Tα1-TP5融合肽體內外免疫活性研究，表明融合肽Tα1-TP5在促進昆明小鼠脾細胞的增殖、增加巨噬細胞的吞