UCMSCs和ECFCs聯合移植及培養(yǎng)基質促進糖尿病小鼠創(chuàng)面修復的作用.pdf

1、目的:
　　研究探討臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)、內皮克隆形成細胞(endothelial colony-formingcells，ECFCs)、細胞培養(yǎng)基質及兩種細胞聯合治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的有效性，觀察單種細胞、細胞自分泌因子、聯合細胞治療糖尿病創(chuàng)面修復的作用，并探討相關的作用機制。
　　方法:
　　1.建立糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷模型:將3

2、6只7周齡db/db小鼠適應性飼養(yǎng)1周后稱重、測血糖大于16.7mmol/L。麻醉后用直徑為6mm的打孔器在小鼠背部制備圓形創(chuàng)面。
　　2.動物分組:A組:內皮克隆形成細胞(ECFCs)組(n=6);B組:ECFC-CM(conditioned medium)組(n=6);C組:臍帶來源的間充質干細胞(MSC)組(n=6);D組:MSC-CM(conditioned medium)組(n=6);E組:ECFCs及UCMSCs組，即

3、混合細胞組(n=6);F組:PBS對照組(n=6)。
　　3.細胞移植:模型建立成功后，在A組、B組分別沿創(chuàng)面旁開2-3mm左右4個位點進行多點皮下注射CM-DiI標記的ECFCs和UCMSCs（細胞注射總量為1*10^6個/只，共100ul）;C組、D組分別采用同上的方法皮下注射用M199培養(yǎng)的同等細胞數（1*10^6個）ECFCs和UCMSCs培養(yǎng)基的上清液（100ul/只），即ECFC-CM、UCMSC-CM;E組皮下注射E

4、CFCs及UCMSCs（即0.5*10^6個ECFCs及0.5*10^6個UCMSCs混合細胞組）;F組為對照組，注射PBS（100ul/只）。移植后，應用水膠體敷料覆蓋創(chuàng)面。
　　4.取材觀察指標:用照相機每隔一日對所有小鼠創(chuàng)面進行拍照，記錄創(chuàng)面愈合情況，同時記錄血糖及體重。分別在細胞及其培養(yǎng)基移植后第18天取材ECFCs及UCMSCs組小鼠的全層皮膚組織，并制作成冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察CM-DiI標記后的細胞在移植后的具

5、體定位;采用H-E染色法及vWF免疫組化法觀察皮膚組織的新生毛細血管密度變化;采用Western Blot方法檢測促血管生成因子及信號通路蛋白的表達。
　　結果:
　　細胞及培養(yǎng)基質移植治療后，每2天監(jiān)測小鼠隨機體重及血糖，各組小鼠體重隨著時間的延長逐漸增加，組間體重無明顯差異(P＞0.05);血糖均大于16.7mmol/L，組間血糖無明顯差異（P＞0.05）;創(chuàng)緣可見鮮紅色、顆粒狀、柔軟濕潤的肉芽組織逐漸形成并填補創(chuàng)口組織

6、缺損。移植細胞組及CM組較對照組（PBS組）傷口愈合時間明顯縮短，其中混合細胞組傷口愈合最快，其愈合速率較其他各組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，ECFC、ECFC-CM、UCMSCs、MSC-CM愈合速率無明顯差異（P＞0.05），但比PBS對照組傷口愈合時間短。移植細胞及其自分泌因子第18天后，用Western Blot檢測創(chuàng)緣皮膚組織中VEGF、AKT、pAKT、ERK1/2的蛋白表達量，結果顯示:ECFCs、ECFC-CM、UCM

7、SCs、UCMSC-CM及聯合移植組的VEGF蛋白含量明顯高于PBSs組，差異有統(tǒng)計學意義（單獨移植組P＜0.05，聯合移植組P＜0.01），細胞移植及自分泌因子組可使VEGF分泌增加。聯合移植組VEGF蛋白表達量高于單獨移植組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，提示聯合細胞移植后VEGF蛋白表達量最高。單獨細胞及自分泌因子移植組VEGF蛋白表達無明顯變化，組間比較無差異(P＞0.05)。而信號通路蛋白AKT、pAKT、ERK1/2蛋白

8、測定結果提示，ECFCs、ECFC-CM、UCMSCs、UCMSC-CM及聯合移植組的表達量明顯高于PBSs組，差異有統(tǒng)計學意義（單獨移植組與PBS組相比，P＜0.05;聯合移植組與PBS組相比，P＜0.01）;聯合移植組蛋白表達量最高，與單獨移植及自分泌因子組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);單獨移植組及自分泌組組間比較無差異（P＞0.05）。提示ECFCs及UCMSCs在促進創(chuàng)面血管新生、促進組織修復中可能存在自分泌VEGF發(fā)

9、揮作用，而聯合細胞移植可能更有利于VEGF自分泌而促進血管新生及組織修復。
　　結論:
　　1.UCMSCs、ECFCs及其自分泌因子移植能有效促進新生血管形成，加速組織修復。
　　2.UCMSCs和ECFCs兩種細胞聯合移植具有協同作用，比單獨移植一種細胞或自分泌因子促血管新生及組織修復作用更顯著。
　　3.ECFCs及其自分泌因子對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的修復作用可達到與UCMSCs及其自分泌因子相同的效果，為臨