中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Sipl-Smad信號(hào)通路在髓鞘生成中的作用.pdf

1、一.研究目的:研究Smad相互作用蛋白-1(Sipl/Zfhx1b)對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的調(diào)節(jié)作用,以及發(fā)現(xiàn)Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和啟動(dòng)髓鞘生成作用的分子機(jī)制。
　　二.研究方法:1.Sip1/Zfhx1b在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟中的作用:(1)免疫染色法測(cè)定Sip1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞豐富區(qū)域的表達(dá)情況;(2)原位雜交技術(shù)確定Sip1在脊髓中的發(fā)育情況;(3)建

2、立少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sip1特異性敲除模型,評(píng)價(jià)Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影響;(4)Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位雜交技術(shù)評(píng)價(jià)與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的相關(guān)標(biāo)記物的變化情況;(5)電鏡下觀察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的變化情況;(6)免疫染色法評(píng)價(jià)體外敲除Sip1基因?qū)ι偻荒z質(zhì)細(xì)胞的影響;(7)Sip1敲除小鼠模型中,原位雜交技術(shù)確定OPC的增殖能力的改變情況。2. Sipl/Zfhx1b調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和啟動(dòng)髓

3、鞘生成作用的分子機(jī)制研究:2.1 Sipl/Zfhx1b調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)通路的分子機(jī)制研究(1)熒光素酶報(bào)告基因法確定Sip1對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)的調(diào)控因子和髓鞘基因的改變情況;(2)免疫共沉淀法和Western-blotting法檢測(cè)Smad通路蛋白的表達(dá)情況;(3)免疫熒光法測(cè)定磷酸化Smad1的在體內(nèi)的變化;(4)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)在OPC內(nèi)過(guò)表達(dá)Sip1后OPC的分化成熟情況;(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

4、過(guò)表達(dá)Sip1后與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)通路的改變情況;(6)原位雜交技術(shù),免疫染色法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)髓鞘相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)情況;(7)染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)Sip1與少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力。2.2 Sip1/Zfhx1b調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟時(shí)直接下游基因的鑒別(1) Gene-chip microarray法鑒別Sip1直接作用的下游基因;(2)原位雜交技術(shù)觀察Smad7在老鼠脊髓發(fā)育過(guò)程的表達(dá)情

5、況;(3)免疫染色法觀察Smad7在脊髓少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;(4)雞胚神經(jīng)管內(nèi)過(guò)表達(dá)Smad7對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的影響;(5)免疫熒光法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Smad7和Sip1在OPC和OLs兩個(gè)階段的表達(dá)情況;(6)染色質(zhì)免疫共沉淀法測(cè)定Sip1結(jié)合Smad7啟動(dòng)子的能力;(7)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Sip1過(guò)表達(dá)后對(duì)Smad7的影響;(8)免疫熒光法測(cè)定Smad7過(guò)表達(dá)后對(duì)Sip1缺失的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響;(9)

6、Western blot法測(cè)定Smad7過(guò)表達(dá)后對(duì)BMP信號(hào)通路和其他通路的影響;(10)Smad7敲除小鼠模型中,原位雜交技術(shù)評(píng)價(jià)與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的相關(guān)標(biāo)記物的變化情況。
　　三.研究結(jié)果:1. Sipl/Zfhxlb敲除引起少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘生成的缺陷(1)Sip1表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)腦的皮層和白質(zhì)區(qū)域以及脊髓的白質(zhì)區(qū)較多,并且在成熟的CC1+的OLs內(nèi)表達(dá)較強(qiáng),而在PDGFRα+的OPC內(nèi)表達(dá)相對(duì)較

7、弱；(2)胚胎期E14.5～16.5時(shí),Sip1在脊髓的白質(zhì)區(qū)域沒(méi)有表達(dá),而在生后當(dāng)天(P0)在脊髓的腹側(cè)出現(xiàn),隨著時(shí)間增加表達(dá)不斷增多;(3)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Sip1特異性敲除小鼠(Sip1cKO)出現(xiàn)震顫,發(fā)抖,共濟(jì)失調(diào)性步態(tài)行走等表型,并且在兩周左右出現(xiàn)死亡;(4) Sip1cKO小鼠中,成熟髓鞘蛋白髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP1)在脊髄和大腦白質(zhì)區(qū)域明顯下降或完全消失,CC1蛋白表達(dá)明顯下降;(5) P14 Sip

8、1cKO小鼠視神經(jīng)和脊髓內(nèi)幾乎沒(méi)有髓鞘的生成;(6) Cre-GFP病毒感染的Sipc/c細(xì)胞分化能力明顯減弱,細(xì)胞的分化被阻斷在OPC階段;(7)P14的Sip1cKO小鼠和野生型小鼠PDGFRα+的細(xì)胞沒(méi)有明顯差異,OPC增殖能力也未受到影響。2. Sip1/Zfhx1b通過(guò)BMP/Smad通路調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟和啟動(dòng)髓鞘生成2.1 Sip1/Zfhx1b通過(guò)和p-Smad1相互作用調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟:(1)Sipl和受

9、體激活的Smad1相互作用逆轉(zhuǎn)BMP通路對(duì)MBP啟動(dòng)子的抑制作用,也可改變BMP通路對(duì)Id2,Id4和Hes1的活化作用;(2)Co-IP結(jié)果表明Sip1只能同磷酸化的Smad1相互結(jié)合;在少突膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)中,Sip1在OLs蛋白表達(dá)增加,并且通過(guò)p300介導(dǎo)同p-Smad1相互作用;(3)pSmad1的表達(dá)在P14Sip1cKO和野生型小鼠脊髓腹側(cè)部中沒(méi)有明顯變化;(4)OPC內(nèi)過(guò)表達(dá)Sipl后,Rip+成熟前少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞量明

10、顯增加,PDGFRa+的OPC細(xì)胞量顯著減少;(5)在HCN細(xì)胞內(nèi)電轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)Sip1,24h后Sip1mRNA水平升高,同少突膠質(zhì)細(xì)胞形成正相關(guān)的一些因子mRNA水平也明顯增加;而在Oli-neu細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sip1可顯著降低抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的mRNA水平;(6)P14的Sip1cKO小鼠的脊髓內(nèi)MRF,Sox10和Cgt表達(dá)水平明顯下降;(7)Sip1能同MRF和Sox10的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,而且Sip1能同Id2,Id4和He

11、sl的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。結(jié)合同通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)的甲基化而促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。2.2 Sip1/Zfhx1b通過(guò)誘導(dǎo)Smad7的增加調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟:(1)Gene-chip microarray法鑒別出多種基因都受到Sipl調(diào)控,在其中我們發(fā)現(xiàn)了Smad7可能直接被Sipl調(diào)控;(2)小鼠脊髓發(fā)育過(guò)程中,PO的小鼠脊髓內(nèi)可檢測(cè)到Smad7信號(hào),并且主要集中在白質(zhì)區(qū)腹側(cè)部,隨著時(shí)間的增加在P14達(dá)到峰值,隨后其表達(dá)又下降;(3)脊

12、髓內(nèi),Smad7在OPC和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的兩個(gè)階段都有表達(dá);(4)雞胚神經(jīng)管內(nèi)過(guò)表達(dá)Smad7能促進(jìn)PDGFRα+和Sox10+的異位表達(dá);(5)Smad7和Sip1在OPC和OLs兩個(gè)階段都有表達(dá),但是兩者的蛋白水平和mRNA水平都在OLs內(nèi)表達(dá)增加;(6)OLs內(nèi)Sipl和Smad7啟動(dòng)子的不同區(qū)域結(jié)合能力很強(qiáng),而OPC內(nèi)Sipl完全沒(méi)有結(jié)合到Smad7的啟動(dòng)子區(qū)域;(7)HCN內(nèi)過(guò)表達(dá)Sipl,Smad7mRNA水平明顯增加;(

13、8)Smad7過(guò)表達(dá)可明顯改善Sip1缺失的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化缺陷;(9)Smad7和Smurf1兩者共表達(dá)組,BMPR1a, p-Smad1和β-catenin蛋白水平明顯降低;(10)Smad7敲除小鼠模型中,Mbp和Plpl mRNA明顯降低,但PDGFRa+mRNA水平?jīng)]有明顯改變。
　　四.結(jié)論:(1)體內(nèi)外敲除Sip1都能顯著抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化成熟。(2)體內(nèi)敲除Sip1可引起小鼠的髓鞘生成障礙。(3)Sip1與Sm