糖皮質(zhì)激素受體在I型自身免疫性肝炎患者中的表達(dá)和意義.pdf

1、背景與目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一種累及肝臟實(shí)質(zhì)的,以高γ-球蛋白血癥、循環(huán)中存在自身抗體、組織病理學(xué)表現(xiàn)為以界面性肝炎和小葉性肝炎等為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。它具有遺傳易感性,是誘發(fā)因素、自身抗原抗體應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)紊亂、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡等復(fù)雜因素相互作用的結(jié)果。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)是目前治療AIH的常用藥物,但在臨床上發(fā)現(xiàn),不同的自身免疫性肝炎患者對(duì)糖皮質(zhì)激素治

2、療的反應(yīng)性不同,部分患者對(duì)激素治療不敏感,即使接受大劑量的糖皮質(zhì)激素治療,也得不到預(yù)期的治療效果,甚至出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗,目前對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感,甚至激素抵抗的機(jī)制尚不完全明確,這就需要對(duì)激素抵抗機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮藥理和生理作用的中介物,同樣的疾病個(gè)體對(duì)糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)不同,可能與糖皮質(zhì)激素受體狀態(tài)有關(guān),以往的研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體前信使R

3、NA(GRmRNA)經(jīng)不同的剪接產(chǎn)生兩種高度同源性的亞型,分別是GRαmRNA和GRβmRNA,GRαmRNA是一種配體活化的轉(zhuǎn)錄因子,在激素結(jié)合狀態(tài)下,通過結(jié)合特異性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(Glucocorticold responsive element,GRE)DNA特異序列調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素應(yīng)答基因的表達(dá);相比而言,GRβmRNA可能是糖皮質(zhì)激素效應(yīng)的內(nèi)源性抑制因子,使轉(zhuǎn)錄失活,GRβ蛋白和激素抵抗的發(fā)生相關(guān)早已被熟知,糖皮質(zhì)激素受體維

4、持一定的數(shù)量和功能,使內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素在自身內(nèi)環(huán)境中神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮一定作用,有利于疾病緩解。
　　我們參考了國內(nèi)外大量文獻(xiàn),結(jié)合臨床治療及觀察,本研究旨在通過對(duì)糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)不同的Ⅰ型AIH患者體內(nèi)GRαmRNA和GRβmRNA表達(dá)水平的檢測(cè)以及對(duì)GRβmRNA陽性和GRβmRNA陰性Ⅰ型AIH患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和臨床特征的比較,更深入的了解臨床激素抵抗的機(jī)制,為臨床治療提供參考。
　　材料與方法:標(biāo)本選

5、自2007年6月至2008年9月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院部就診的Ⅰ型AIH患者55例(包括激素敏感型40例、激素抵抗型15例),均為女性,年齡21~59歲,均符合1998年國際自身免疫肝炎小組制定的AIH診斷標(biāo)準(zhǔn),治療前進(jìn)行肝臟穿刺病理學(xué)檢查協(xié)助診斷,排除肝硬化、肝癌、肝衰竭患者,前6個(gè)月內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素治療;20例健康體檢者為正常對(duì)照組。病例組和對(duì)照組性別與年齡均無顯著性差異。激素治療前清晨8時(shí)空腹抽取3ml血液,標(biāo)本取出

6、后立即進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)的提取及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。按TIANGEN公司提供的Trizol-A~+TotalRNA Reagen試劑盒說明書操作程序提取患者血液中的總RNA,用瓊脂糖凝膠電泳(80V,0.5h)檢測(cè)總RNA的28S和18S比例,以評(píng)估總RNA的完整性;用分光光度計(jì)在260/280nm測(cè)定總RNA吸光度,以計(jì)算總RNA的純度;按Promega公司

7、提供的RT-PCR試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。擴(kuò)增產(chǎn)物用含0.5 mmol/L溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳鑒定,并用DBT-08全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)GRαmRNA和GRβmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描和半定量分析;同時(shí)對(duì)Ⅰ型AIH患者的實(shí)驗(yàn)室檢查及臨床特征資料進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用F檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本方差齊性檢驗(yàn),用t或t′檢驗(yàn)及x~2檢驗(yàn)、fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)

8、行顯著性檢驗(yàn);相關(guān)分析采用Pearson(雙變量正態(tài)分布)、Spearman(非正態(tài)分布)直線相關(guān)分析法,求相關(guān)系數(shù)r;以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.各組總RNA提取結(jié)果良好,電泳結(jié)果證實(shí)抽提高純度的總RNA,總RNA的吸光度OD260/OD280值均在1.8~2.0;擴(kuò)增產(chǎn)物各個(gè)條帶清晰,內(nèi)參基因條帶明亮。
　　2.GRαmRNA和GRβmRNA的表達(dá):正常對(duì)照組、激素敏感組及激素抵抗組均可檢測(cè)到GRαmRNA

9、,三組GRαmRNA的陽性表達(dá)率均為100％,正常對(duì)照組、激素敏感組、激素抵抗組三組之間GRαmRNA的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GRβmRNA在正常對(duì)照組中陽性表達(dá)4例(20％),激素敏感組中陽性表達(dá)11例(27.5％),在激素抵抗組中陽性表達(dá)12例(80％),GRβmRNA陽性表達(dá)率在激素抵抗組和正常對(duì)照組、激素抵抗組和激素敏感組中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　3.血清ALT和TB水平在GRβmRNA陽性組

10、和GRβmRNA陰性組Ⅰ型AIH患者中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);黃疸、乏力、食欲不振等的發(fā)生率在GRβmRNA陽性組和GRβmRNA陰性組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GRβmRNA表達(dá)與激素敏感性呈明顯負(fù)相關(guān)(0R=10.545,P<0.05)。
　　4.GRαmRNA和GRβmRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析,隨著GRβmRNA表達(dá)水平的增高,GRαmRNA的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(r=-0.593,P<0.05);GRβmRNA和

11、ALT檢測(cè)值相關(guān)性分析,隨著GRβmRNA表達(dá)水平的增高,ALT的檢測(cè)值呈上升趨勢(shì)(r=0.512,P<0.05)。
　　結(jié)論:1.Ⅰ型AIH患者GRβmRNA的表達(dá)增高與GC治療抵抗有關(guān);GRβmRNA可能是GRαmRNA的一種內(nèi)源性抑制因子。
　　2.Ⅰ型AIH患者復(fù)發(fā)率在GRβmRNA陽性組和GRβmRNA陰性組中是有顯著差異的,提示GRβmRNA的表達(dá)水平和激素的不敏感性密切相關(guān),并且GRβmRNA表達(dá)與激素敏感性呈