滋補(bǔ)腎陰法對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的影響.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，從對(duì)成骨細(xì)胞具有重要調(diào)控作用的Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)的角度，揭示滋陰補(bǔ)腎法治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理，并為闡明中醫(yī)“腎主骨”機(jī)理的科學(xué)內(nèi)涵提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 將55只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組12只、模型組15只、陽(yáng)性對(duì)照組13只、滋補(bǔ)腎陰組15只。模型組大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g體重，給

2、藥濃度為1mg/ml，給藥劑量為1mg/kg體重，每周2次，連續(xù)8w；正常對(duì)照組則相應(yīng)肌注等體積的生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照組及滋補(bǔ)腎陰組除按以上方法肌注地塞米松外，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予阿法骨化醇1ml/100g體重，給藥濃度為0.005μg，/ml，給藥劑量為0.05μg/kg體重；滋補(bǔ)腎陰組灌胃給予左歸丸水煎劑1ml/100g體重，給藥濃度為0.952g生藥/ml，給藥劑量為9.52g生藥/kg體重，以上給藥每天1次，每周6天，連續(xù)8w。

3、r>　　 各組大鼠于處死前16天和前3天分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，采用大鼠麻醉后股動(dòng)脈取血法，所取全血靜置1h后，經(jīng)2000rmp離心10 min后取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清中BGP、E2、PTH、IGF—Ⅰ的水平。取血后將各組大鼠處死，取右側(cè)脛骨近端1/3，制作不脫鈣骨切片，采用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法，檢測(cè)各組大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV％)、骨小梁吸收

4、表面百分比(TRS％)、骨小梁形成表面百分比(TFS％)、骨小梁礦化率(MAR)、類皮質(zhì)平均寬度(OSW)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)，以觀察各組大鼠骨形成及骨吸收等骨代謝情況。取左側(cè)脛骨近端1/3，制作大鼠脛骨脫鈣骨的冰凍切片，分別采用免疫組化、原位雜交法檢測(cè)各組大鼠脛骨成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Wntl、LRP—5及β—catenin蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)：
　　 2.1左歸丸含藥血清的制備
　　

5、 雌性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組和左歸丸治療組，每組10只。左歸丸治療組大鼠：地塞米松0.1mg/100g肌注，每周2次，連續(xù)8w，然后灌服左歸丸，一日2次，連續(xù)5次，于末次給藥1h，乙醚麻醉，無(wú)菌條件下，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，冷置1h后，離心(2500r/min，25min)，分離血清，是為左歸丸含藥血清，56℃滅活30min，—20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常?duì)照組按以上程序，灌服等容積的蒸餾水，所取血清即正常對(duì)照組血清。

6、
　　 2.2 MTT法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)分為6組：成骨細(xì)胞(OB)+正常血清組，OB+10—7 mol/L地塞米松組，OB+10—8 mol/L地塞米松組，OB+5％左歸丸含藥血清組、OB+10％左歸丸含藥血清組、OB+15％左歸丸含藥血清組，每組8個(gè)樣本。將成骨細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)至為1×104/ml，將其接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μl，培養(yǎng)12h細(xì)胞貼壁后，分別用正常對(duì)照組血清1

7、0—7 mol/L地塞米松、10—8 mol/L地塞米松、5％左歸丸含藥血清、10％左歸丸含藥血清、15％左歸丸含藥血清處理各組細(xì)胞，5％CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)96h，然后用MTT法于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm處各種細(xì)胞的OD值。
　　 2.3左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA表達(dá)的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)分為3組：正常血清組，地塞米松組，左歸丸含藥血清組。培養(yǎng)12h后，分別用正

8、常對(duì)照組血清、10—7 mol/L地塞米松、15％左歸丸含藥血清處理各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)96h。隨后分別采用免疫印跡法及熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime PCR.)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間兩兩比較，采用q檢驗(yàn)。
　　 結(jié)論：

9、>　　 滋補(bǔ)腎陰法對(duì)糖皮質(zhì)激素所致大鼠的骨質(zhì)疏松癥具有明顯的治療作用，其作用途徑有三：第一，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，進(jìn)而使骨形成增加。第二，使Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子——Wnt、LRP及β—catenin的表達(dá)上調(diào)。具體途徑是，增強(qiáng)Wnt信號(hào)，使其與受體LRP的結(jié)合增多，則β—catenin蛋白不會(huì)被降解而在胞內(nèi)聚集，從而可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合激活基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這一方面促進(jìn)了成骨細(xì)胞的定向、分化、發(fā)育、增殖，并抑制