鋅轉(zhuǎn)運蛋白Zip11的功能及沙門氏菌攻擊對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機理研究.pdf

1、鋅是機體必需的微量元素，機體需要準確地調(diào)節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)平衡，讓鋅水平維持在正常的范圍內(nèi)。機體的鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控主要是由鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZNT與ZIP家族負責(zé)。ZIP11則是ZIP家族全新的基因，之前尚未見關(guān)于ZIP11功能的研究報道。由沙門氏菌污染禽肉引起的人食源性疾病仍然是世界衛(wèi)生組織面臨的主要問題之一。肉雞大腸桿菌感染或內(nèi)毒素刺激均會出現(xiàn)典型的“低鋅血癥”，血清鋅降低，肝臟鋅升高;同時多項研究暗示病原微生物感染可能會影響機體先天免疫細胞（如中性粒細胞

2、與巨噬細胞）的鋅穩(wěn)態(tài)。但沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響與調(diào)控機理目前仍不清楚。鋅轉(zhuǎn)運蛋白在其中的作用也是未知，ZIP11是否參與其中有待研究。本研究將全面系統(tǒng)地回答這些問題，共開展以下三項研究:
　　實驗一:ZIP11在機體鋅代謝中的作用與機理研究
　　本研究以野生型小鼠與細胞系為模型，全面系統(tǒng)地研究ZIP11在機體鋅代謝中的作用與機理。首先通過生物信息學(xué)分析ZIP家族在真核上的分布規(guī)律與進化關(guān)系，從不同的真核生物類群（如哺

3、乳動物、脊椎動物、植物與原生動物等）中挑選了25種具有代表性的真核生物的ZIP基因進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZIP11是ZIP家族gufA亞家族的唯一成員，起源于真核生物早期的祖先。在分析Zip11在小鼠不同組織中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)mZip11在消化系統(tǒng)中高表達（胃、回腸與盲腸）。而在HEK293T細胞上轉(zhuǎn)染mZIP11質(zhì)粒與在RAW26.7細胞上沉默Zip11后，測定細胞內(nèi)鋅含量與MT的基因表達，證實ZIP11是一個鋅的轉(zhuǎn)入蛋白。給野生型小鼠

4、補鋅后，發(fā)現(xiàn)Zip11無論是mRNA還是蛋白水平均顯著升高。隨后的熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)Zip11第一個外顯子上游區(qū)域存在多個MRE序列，可響應(yīng)細胞內(nèi)鋅的變化。突變分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多MRE可調(diào)控Zip11啟動子的活性，MTF-1參與到Zip11表達調(diào)控的過程中?？傊?，本實驗結(jié)果表明ZIP11具有特殊的序列與結(jié)構(gòu)特征，負責(zé)細胞內(nèi)鋅的轉(zhuǎn)運，鋅通過MTF-1綁定到Zip11啟動子區(qū)域的MRE序列上調(diào)控Zip11的基因表達。
　　實驗二

5、:沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機理研究
　　實驗選用48只1dAA肉公雞，飼養(yǎng)7d后按體重?zé)o差異原則隨機分為兩組:一組為對照組，另外一組為沙門氏菌攻毒組。分別在攻毒后第1、3與7d收集血清、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊、十二指腸、空腸、回腸與盲腸等組織，用于鋅含量與鋅代謝相關(guān)基因的分析。同時，分離正常與被感染雞只的血液中性粒細胞，檢測鈣衛(wèi)蛋白與鋅代謝相關(guān)基因的表達。研究表明，7d肉雞沙門氏菌感染后血清鋅顯著降低(P＜0.05)

6、，肝臟鋅明顯升高(P＜0.05)，機體出現(xiàn)了典型的“低鋅血癥”。與對照組相比感染組十二指腸中鋅含量極顯著降低(P＜0.01)，但法氏囊與盲腸中的鋅含量顯著升高(P＜0.05)。機體通過限制十二指腸對鋅的吸收，同時將鋅重分布到肝臟、法氏囊與盲腸等組織，從整體上調(diào)控鋅的穩(wěn)態(tài)平衡，來限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。除此之外，沙門氏菌感染后極顯著地增加中性粒細胞MT與S100A9的表達(P＜0.01)。機體通過改變中性粒細胞的鋅穩(wěn)態(tài)，從而介導(dǎo)鈣衛(wèi)

7、蛋白的表達與分泌，分泌到腸腔中的鈣衛(wèi)蛋白會螯合掉食糜中的鋅，進一步限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。沙門氏菌感染對肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)的影響主要是通過顯著改變宿主鋅轉(zhuǎn)運蛋白的表達來實現(xiàn)的(P＜0.05)。宿主通過上調(diào)鋅的轉(zhuǎn)入蛋白ZIP14，下調(diào)鋅的轉(zhuǎn)出蛋白ZNT1、ZNT4、ZNT5、ZNT6、ZNT8與ZNT9的表達將鋅重分布到肝臟;此外下調(diào)ZIP5、ZIP10、ZIP11、ZIP12、ZIP13與ZIP14在十二指腸中的表達，限制鋅的吸收。進一

8、步研究發(fā)現(xiàn)，機體會上調(diào)中性粒細胞中的鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZIP3、ZIP8、ZIP10與ZIP14的表達，增加中性粒細胞中的鋅含量，從而極顯著增加鈣衛(wèi)蛋白的表達(P＜0.01)?？傊抽T氏菌感染顯著影響肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)。機體通過調(diào)控鋅轉(zhuǎn)運蛋白的表達在整體水平與細胞水平上分別介導(dǎo)鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控，來共同抵抗沙門氏菌的感染。多個鋅轉(zhuǎn)運蛋白在這個過程中發(fā)揮重要的作用，ZIP11也參與到其中。
　　實驗三:巨噬細胞游離鋅調(diào)控在抗沙門氏菌感染中的作用與機理研

9、究
　　本研究以RAW264.7巨噬細胞為模型，在沙門氏菌感染的同時，通過添加鋅或鋅螯合劑改變巨噬細胞內(nèi)游離鋅的水平，利用熒光顯微、流式細胞儀、RT-PCR與免疫印跡等技術(shù)檢考察游離鋅改變對沙門氏菌感染與增殖的影響;同時考察游離鋅改變對宿主NF-κB信號通路以及ROS與RNS產(chǎn)生的影響。除此之外，還在MT1敲除的RAW264.7巨噬細胞上驗證之前的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞感染沙門氏菌后游離鋅會聚集在巨噬細胞內(nèi)，并影響沙門氏菌的感染

10、。螯合巨噬細胞內(nèi)的游離鋅通過增加巨噬細胞ROS與RNS的產(chǎn)生，增加巨噬細胞對沙門氏菌的殺傷，從而減少沙門氏菌的感染。相反，額外增加巨噬細胞的水平通過影響NF-κB p65的激活，減少ROS與RNS的產(chǎn)生，結(jié)果沙門氏菌在巨噬細胞內(nèi)生長得更好。在敲掉細胞內(nèi)重要的游離鋅綁定蛋白MT1后，沙門氏菌在MT1敲除的巨噬細胞內(nèi)生長的更好。這是由于伴隨巨噬細胞內(nèi)游離鋅含量升高的同時，細胞內(nèi)ROS與RNS的產(chǎn)生也減少。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌陽性的細胞相比沙

11、門氏菌陰性的細胞含有更多的自由鋅，而ROS與RNS的產(chǎn)生被抑制。這暗示感染后巨噬細胞游離鋅的聚集可能是沙門氏菌逃避NF-κB介導(dǎo)的巨噬細胞殺傷，長久地在巨噬細胞內(nèi)生存的新策略。
　　綜上所述，ZIP11是一個鋅轉(zhuǎn)運蛋白，在機體鋅代謝過程中發(fā)揮重要作用。此外，ZIP11的mRNA與蛋白水平均受鋅調(diào)控，鋅調(diào)控ZIP11的表達主要通過MTF-1綁定到ZIP11啟動子區(qū)域的MRE序列上來實現(xiàn)。肉雞沙門氏菌感染后，機體通過調(diào)控十二指腸鋅的吸