磁性納米四氧化三鐵顆粒聯(lián)合5-溴漢防已甲素在逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　 多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）惡性血液病化療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因，逆轉(zhuǎn)MDR對(duì)白血病的治療有重要意義。本研究旨在探討磁性納米四氧化三鐵顆粒（magneticnanoparticle of Fe3O4，F(xiàn)e3O4-MNPs）和5-溴漢防己甲素（5-bromotetrandrine，BrTet）單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)、外協(xié)同化療藥物逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株K562/AO2細(xì)胞多藥耐藥的療效，研究其逆

2、轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用甲基四唑藍(lán)法（MTT）法檢測(cè)Fe3O4-MNPs、BrTet單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同化療藥物柔紅霉素（daunorubicin，DNR）對(duì)K562/AO2細(xì)胞和K562細(xì)胞增殖影響的變化，并計(jì)算IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（fold reversal，F(xiàn)R）；
　　 2.采用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞凋亡“DNA ladder”；采用流式細(xì)

3、胞儀（flow cytometry FCM）檢測(cè)K562細(xì)胞、K562/AO2細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞內(nèi)DNR濃度；采用FCM檢測(cè)正常人外周血造血干細(xì)胞在藥物作用后細(xì)胞內(nèi)DNR濃度；
　　 3.建立裸小鼠皮下移植瘤模型，比較Fe3O4-MNPs、BrTet在體內(nèi)的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，觀察藥物對(duì)裸小鼠重要臟器的影響；
　　 4.采用Western blot法檢測(cè)藥物作用后K562/AO2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、wt p53

4、、Fas、Caspase-3和耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的蛋白表達(dá)；
　　 5.采用Real time RT-PCR方法檢測(cè)藥物作用后K562/AO2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、wt p53、Fas、Caspase-3和耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.K562和K562/AO2細(xì)胞的IC50分別為0

5、.56±0.04mg/L和18.18±0.02mg/L，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨(dú)或聯(lián)合）處理后DNR對(duì)K562細(xì)胞的IC50均無(wú)明顯變化；加用Fe3O4-MNPs和BrTet處理后DNR對(duì)K562/AO2細(xì)胞的IC50分別為4.23±0.05mg/L、2.424±0.03mg/L，兩藥聯(lián)合作用后DNR對(duì)K562細(xì)胞的IC50值為1.024±0.08mg/L，逆轉(zhuǎn)劑處理前后DNR對(duì)K562/AO2細(xì)胞的IC50有顯著差異

6、。
　　 2.單用DNR時(shí)K562細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度為105.10±15.41，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨(dú)或聯(lián)合）處理后細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度較單用DNR組細(xì)胞無(wú)明顯提高；K562/AO2細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度為29.53±3.65，F(xiàn)e3O4-MNPs以及BrTet聯(lián)合DNR分別作用于K562/AO2細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度較單用DNR組細(xì)胞明顯提高，兩藥聯(lián)合作用后細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光

7、強(qiáng)度較單用DNR組、Fe3O4-MNPs逆轉(zhuǎn)組、BrTet逆轉(zhuǎn)組均明顯提高；單用DNR時(shí)PBHSC細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度為302.71±14.12，說(shuō)明DNR對(duì)PBSCT細(xì)胞的毒性比K562/AO2細(xì)胞大；加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨(dú)或聯(lián)合）處理后較單用DNR組均無(wú)明顯提高。
　　 3.K562細(xì)胞以及K562/AO2細(xì)胞成瘤率均為100％；對(duì)于K562移植瘤，各組之間腫瘤抑制率差異無(wú)顯著性；對(duì)于K562/AO2

8、移植瘤，F(xiàn)e3O4-MNPs協(xié)同DNR、BrTet協(xié)同DNR及Fe3O4-MNPs聯(lián)合BrTet協(xié)同DNR組均可明顯抑制移植瘤的增殖，腫瘤抑制率分別為28.17±0.98％、43.88±0.47％、62.274±0.48％，而單用DNR組的腫瘤抑制率僅為3.67±0.08％，差異有顯著性；同時(shí)腫瘤組織病理觀察顯示聯(lián)合逆轉(zhuǎn)組腫瘤細(xì)胞死亡明顯，各實(shí)驗(yàn)組心、腎、脾等臟器無(wú)明顯病理改變。
　　 4.當(dāng)不同藥物分別依次作用于K562細(xì)胞4

9、8小時(shí)后，空白對(duì)照組、單用Fe3O4-MNPs、BrTet時(shí)K562細(xì)胞凋亡率分別為4.33±0.45％、4.60±0.62％、4.274±0.81％，單用DNR時(shí)K562細(xì)胞凋亡率為51.534±0.71％，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨(dú)或聯(lián)合）處理后K562細(xì)胞凋亡率與單用DNR組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)不同藥物分別依次作用于K562/AO2細(xì)胞48小時(shí)后，空白對(duì)照組、單用Fe3O4-MNPs、BrTet時(shí)細(xì)胞凋亡率分別

10、為2.454±0.35％、2.724±0.42％、2.684±0.67％，單用DNR時(shí)細(xì)胞凋亡率為6.744±0.38％，與單用DNR相比，F(xiàn)e3O4-MNPs、BrTet聯(lián)合DNR組K562/AO2細(xì)胞凋亡率明顯增加，分別為13.14±0.29％、57.24±1.16％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DNR、Fe3O4-MNPs、BrTet三者聯(lián)合時(shí)K562/AO2細(xì)胞凋亡率最高，較DNR單用及聯(lián)合Fe3O4-MNPs、BrTet組均明顯增加達(dá)

11、67.83±1.37％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.和K562細(xì)胞相比，K562/AO2細(xì)胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高，Bax，wtp53及Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平較低，F(xiàn)as的mRNA表達(dá)水平較低，蛋白量無(wú)明顯差異；Fe3O4-MNPs可下調(diào)K562/AO2細(xì)胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Bax及Fas mRNA和蛋白的表達(dá)，對(duì)wtp53和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)

12、水平無(wú)明顯影響；BrTet能上調(diào)K562/AO2細(xì)胞的Fas mRNA和蛋白水平，對(duì)Bcl-2，Bax，wt p53及Caspase-3的轉(zhuǎn)錄和蛋白無(wú)明顯影響；
　　 6.K562/AO2細(xì)胞的Mdr1，Mrp1，Mrp2，Mrp4和Mrp5的mRNA水平明顯較K562細(xì)胞高，而Mrp3mRNA表達(dá)水平低于K562細(xì)胞，兩者的Bcrp和Lrp表達(dá)水平無(wú)明顯差別。Fe3O4-MNPs對(duì)K562/AO2細(xì)胞的Mdr1、Mrp1、Mr

13、p2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平均有下調(diào)作用，與DNR聯(lián)合應(yīng)用后下調(diào)作用更加明顯，BrTet單用對(duì)Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平也有明顯的下調(diào)作用，與DNR聯(lián)合應(yīng)用后，以上幾種基因的mRNA表達(dá)下調(diào)更加顯著，但蛋白水平僅Mdr1、Mrp1表達(dá)下調(diào)，Mrp2、Mrp4、Mrp5明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.10ug/mL Fe3O4-MNPs對(duì)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞

14、無(wú)增敏作用，在體外、體內(nèi)均可逆轉(zhuǎn)耐藥株K562/AO2對(duì)DNR的耐藥，不增加造血干細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度說(shuō)明其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的靶向性，對(duì)正常細(xì)胞的影響小，安全性較好，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也未增加化療藥物的損害。
　　 2.0.35μg/ml BrTet對(duì)白血病敏感細(xì)胞株K562無(wú)增敏作用，在體外、體內(nèi)均觀察到可明顯逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細(xì)胞株K562/AO2對(duì)化療藥物的耐藥性，不增加造血干細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也未增加對(duì)重要臟器的損害，具

15、有良好的安全性。
　　 3.Fe3O4-MNPs與BrTet兩者聯(lián)合逆轉(zhuǎn)K562/AO2對(duì)DNR的耐藥，在體外和體內(nèi)均顯示出明顯的協(xié)同作用。且此濃度下兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用均不增加化療藥物對(duì)造血干細(xì)胞的殺傷及細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度，聯(lián)合應(yīng)用在增加療效的同時(shí)并未增加毒副作用，有較好的安全性。
　　 4.BrTet逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細(xì)胞株K562/AO2細(xì)胞耐藥的作用機(jī)制可能主要為從基因和蛋白水平抑制了多藥耐藥相關(guān)基因Mdr1、M

16、rp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的表達(dá)，其中Mdr1、Mrp1是主要的作用位點(diǎn)；BrTet并非通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)克服耐藥，但可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度從而增強(qiáng)了化療藥物的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，在對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響方面，僅對(duì)Fas轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平有輕度的上調(diào)作用，對(duì)Bcl-2，Bax，wt p53和Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)均無(wú)明顯影響。
　　 5.Fe3O4-MNPs從基因和蛋白水平對(duì)多種耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1

17、、Mrp2、Mrp4、Mrp5均有下調(diào)作用，在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后此作用更強(qiáng)。Fe3O4-MNPs本身無(wú)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用，但可增強(qiáng)化療藥物的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，可下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax mRNA和蛋白水平，上調(diào)Fas mRNA和蛋白水平，但作用均較弱，在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后此作用明顯增強(qiáng)，對(duì)wt p53和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯的影響，但在聯(lián)合化療藥物后明顯上調(diào)。說(shuō)明Fe3O4-MNPs克服腫瘤耐藥的機(jī)