紅豆杉多糖對(duì)AD小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是多發(fā)生于老年期及老年前期的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征,臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視覺(jué)空間能力損害、抽象思維和計(jì)算能力損害、人格和行為的改變的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。隨著我國(guó)國(guó)家國(guó)民經(jīng)濟(jì)的上升，人民生活水平的提高，我國(guó)老年化進(jìn)程逐年加劇，癡呆人口也隨著增加。據(jù)報(bào)道[1,2]：隨著人口老齡化的加劇，2010年我國(guó)阿爾茨海默病患者人數(shù)已成

2、為世界第一位，我國(guó)最終將成為名副其實(shí)的“AD大國(guó)”，擁有全世界最多的AD患者和最快的AD增長(zhǎng)速度。如此迅猛增加的疾病負(fù)擔(dān)必將對(duì)我國(guó)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和家庭生活產(chǎn)生重要的影響。AD的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，目前研究主要集中于神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、自由基等學(xué)說(shuō)[3]。由于AD的發(fā)病機(jī)理仍不十分明確，迄今尚未找到行之有效的治療藥物，目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)的藥物只有膽堿酯酶抑制劑和谷氨酸受體阻斷劑，這些藥物雖可以緩解癥狀，可以在一定程度上改善

3、AD患者的認(rèn)知和行為能力，但其療效均十分有限，難以終止疾病的進(jìn)展、逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)程。因此研究的重點(diǎn)在于AD的早期干預(yù)，所以努力探索和積極尋找能有效延緩病情發(fā)展及預(yù)防疾病發(fā)生的藥物，已成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)界亟待解決和攻克的重點(diǎn)課題。
　　近年來(lái)，隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)多種復(fù)方中藥及中藥單品被發(fā)現(xiàn)可用于AD的臨床治療，隨著技術(shù)的進(jìn)展，中藥提取技術(shù)的不斷純熟。已發(fā)現(xiàn)許多中藥提取物可用AD的治療，目前主要有：銀杏葉及其提取物可用于治

4、療老年癡呆治療已獲得德國(guó)聯(lián)邦政府衛(wèi)生部門的批準(zhǔn)[4-6]；枸杞多糖[7]用于治療老年癡呆的研究獲也已獲得國(guó)際上的認(rèn)可；同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肉蓯多糖[8]等均具有改善AD模型的學(xué)習(xí)記憶能力。多糖被列為目前研究的熱點(diǎn)項(xiàng)目。
　　課題組成員近年致力于紅豆杉多糖的研究10余年，已取得顯著成果，目前已完成多糖提取分離及純度測(cè)定技術(shù)（獲國(guó)家發(fā)明專利：ZL03129421.9），同時(shí)已完成紅豆杉多糖安全性實(shí)驗(yàn)，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該多糖具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)

5、節(jié)免疫、干預(yù)心肌缺血再灌注損傷（獲國(guó)家發(fā)明專利：200810120862.2）等多種生物學(xué)特性和功能[9-10]。近年在臨床實(shí)踐中觀察到紅豆杉多糖能改善AD患者的學(xué)習(xí)及記憶能力，根據(jù)課題組前期系列研究成果推測(cè)其可通過(guò)抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮改善AD小鼠模型學(xué)習(xí)及記憶能力。所以本研究以紅豆杉多糖作用于AD小鼠模型，以期證實(shí)其對(duì)AD小鼠模型的學(xué)習(xí)及記憶能力的影響作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)理。
　　第一章紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)

6、及記憶能力的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機(jī)分成為空白組，模型組，陽(yáng)性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只?？瞻捉M頸部皮下注射生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg.d，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽(yáng)性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg

7、/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800 mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖，末次給藥后，利用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　結(jié)果：
　?。?）各組小鼠體重變化未見明顯差異；（2）定位航行實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組、紅豆杉多糖各劑量組與模型組對(duì)比，小鼠學(xué)習(xí)潛伏期縮短(P＜0.05, P＜0.01)；（3）空間探索實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組、多奈哌齊陽(yáng)性藥物組、紅豆杉多糖低、中、高

8、劑量組小鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05,P＜0.01）。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)，各組小鼠總游程段潛伏期逐漸降低。說(shuō)明紅豆杉多糖及鹽酸多奈哌齊均對(duì)AD模型學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。其中以紅豆杉多糖低劑量組及鹽酸多奈哌齊陽(yáng)性藥物組的迷宮結(jié)果與模型組比較，差異較為明顯。提示紅豆杉多糖可改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　結(jié)論：
　　紅豆杉多糖具有改善AD模型學(xué)習(xí)及記憶能力的作用；根據(jù)課題組前期研究，

9、推測(cè)其可能通過(guò)抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等從而發(fā)揮其改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用。
　　第二章紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠海馬氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機(jī)分為空白組，模型組，陽(yáng)性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只?？瞻捉M頸部皮下注射等量生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/k

10、g.d注射，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽(yáng)性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖，末次給藥后，隨機(jī)取12只小鼠腦組織勻漿，比色法檢測(cè)小鼠腦組織中SOD活性及MDA含量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腦組織總抗氧化能力；隨機(jī)取4只小鼠腦組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)海馬區(qū)Nrf2的表達(dá)；
　　結(jié)果：

11、
　　D-半乳糖模型組與空白組比較，腦組織勻漿中SOD活性明顯降低、MDA含量均明顯升高（P＜0.05, P＜0.01）。紅豆杉多糖各劑量組、陽(yáng)性藥物組與模型組比較，腦組織勻漿中SOD活性明顯提高、MDA含量明顯減低（P＜0.05,P＜0.01），以紅豆杉多糖中、低劑量組升高或者降低明顯（P＜0.01）；D-半乳糖模型組的T-AOC低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；紅豆杉多糖高、中、低劑量組及多奈哌齊陽(yáng)性藥物組T-AOC皆高于D-半

12、乳糖模型組（P＜0.05, P＜0.01）；D-半乳糖模型組與空白組比較海馬區(qū)Nrf-2的表達(dá)的IOD值比較明顯下降（P＜0.05），鹽酸多奈哌齊陽(yáng)性藥物組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組與D-半乳糖模型組比較，腦組織海馬區(qū)Nrf-2的表達(dá)的IOD值均升高（P＜0.05, P＜0.01），其中以紅豆杉多糖中劑量升高最為明顯（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　紅豆杉多糖改善AD小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力可能與其抗腦組織氧化應(yīng)激損害相關(guān)。<

13、br>　　第三章紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡及Aβ的影響
　　目的：
　　探討紅豆杉多糖對(duì)AD模型小鼠海馬細(xì)胞凋亡及海馬Aβ淀粉樣沉積的影響。
　　方法：
　　雄性ICR小鼠120只隨機(jī)分為空白組，模型組，陽(yáng)性藥物組（鹽酸多奈哌齊），紅豆杉多糖低、中、高劑量組，每組20只?？瞻捉M頸部皮下注射生理鹽水，其余各組頸部皮下注射D-半乳糖1000mg/kg.d注射，共8周，制備AD小鼠模型。造模第4周起，空白

14、組和模型組給予NS10ml/kg.d灌胃，陽(yáng)性藥物組給予鹽酸多奈哌齊1mg/kg.d灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別按200,400,800mg/kg.d，連續(xù)4周灌胃紅豆杉多糖；末次給藥后，隨機(jī)取3只小鼠麻醉后開胸暴露心臟，5％福爾馬林灌注，取腦，HE染色比較海馬細(xì)胞形態(tài)變化；隨機(jī)取4只小鼠進(jìn)行免疫組化檢測(cè)海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)；隨機(jī)取12只小鼠腦組織勻漿，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腦組織勻漿Aβ淀粉樣蛋白的含量；
　　結(jié)果

15、：
　　D-半乳糖模型組與空白組比較，腦組織勻漿中Aβ淀粉樣蛋白含量均明顯升高（P＜0.05）。紅豆杉多糖各劑量組與模型組比較，腦組織勻漿中Aβ淀粉樣蛋白含量，均明顯降低（P＜0.05,P＜0.01）；D-半乳糖模型組與空白對(duì)照組比較，海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)IOD值上升（P＜0.01），紅豆杉多糖低、中劑量組及鹽酸多奈哌齊陽(yáng)性藥物組與D-半乳糖模型組比較，腦組織海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)IOD值下降（P＜0.05, P